VEGF-C基因促進胃癌淋巴管形成及相關(guān)miRNAs鑒定實驗研究.pdf

1、背景與目的:
　　胃癌是常見惡性腫瘤之一，盡管胃癌的發(fā)病率近幾十年來有所下降，但在世界范圍內(nèi)，尤其是亞洲東部地區(qū)，每年的新發(fā)病例量卻不斷在增加。目前全世界所有因惡性腫瘤死亡病例中，因胃癌導(dǎo)致的死亡已高達10％左右，在所有因腫瘤導(dǎo)致的死亡原因中僅次于肺癌排第二位。淋巴轉(zhuǎn)移是胃癌遠隔轉(zhuǎn)移擴散的主要途徑，也是促使胃癌患者死亡的重要因素。然而由于淋巴管內(nèi)皮細胞長期以來沒有很好的特異性標志物，對其研究相對是個盲區(qū)，因此，破解淋巴道轉(zhuǎn)移之謎，

2、成為了攻克胃癌的瓶頸問題，目前淋巴管生成(Lymphangiogenesis)已成為腫瘤轉(zhuǎn)移研究領(lǐng)域的熱點之一。已有的相關(guān)研究報道胃癌組織中VEGF-C的表達增加，提示可能VEGF-C在胃癌淋巴轉(zhuǎn)移中產(chǎn)生作用，盡管已有大量關(guān)于VEGF-C基因的研究，但在胃癌的淋巴道轉(zhuǎn)移機制研究當(dāng)中，單單憑VEGF-C分泌增多及其直接促進淋巴管生成效應(yīng)不足以解釋，這就促使我們尋找其調(diào)控機制。本研究寄希望通過慢病毒轉(zhuǎn)染技術(shù)，構(gòu)建高表達VEGF-C基因人胃癌

3、細胞株，在體外觀察人胃癌細胞中VEGF-C基因高表達對淋巴內(nèi)皮細胞管形成能力的影響，并借助于人胃癌誘導(dǎo)過的淋巴管內(nèi)皮細胞與未處理的淋巴管內(nèi)皮細胞作為研究對象，應(yīng)用高通量的miRNAs芯片技術(shù)比較兩者miRNAs表達譜的差異水平，尋找人胃癌淋巴管生成相關(guān)的miRNAs，深入探索人胃癌淋巴管生成的調(diào)控機制。
　　方法:
　　通過熒光實時定量RT-PCR及Western Blot方法檢測VEGF-C在不同類型的人胃癌細胞株（BGC

4、-823、NCI-N87、SGC-7901、MKN-45、MKN-28、GES-1）中mRNA及蛋白的表達水平，并確定VEGF-C基因或蛋白水平表達較低的細胞株（MKN-45）作為目的細胞。通過構(gòu)建人VEGF-C基因過表達慢病毒載體并感染目的細胞，建立胃癌促淋巴管生成的體外模型，觀察VEGF-C基因高表達對淋巴管內(nèi)皮細胞管形成能力的影響實驗對象分為三組，其中以VEGF-C過表達慢病毒載體感染細胞為實驗組、空白病毒轉(zhuǎn)染為對照組和未轉(zhuǎn)染胃癌

5、細胞為空白組。應(yīng)用高通量miRNAs芯片技術(shù)篩選腫瘤誘導(dǎo)過的淋巴管內(nèi)皮細胞和未處理的淋巴管內(nèi)皮細胞差異表達的miRNAs，采用熒光實時定量PCR技術(shù)對部分候選人胃癌淋巴管生成相關(guān)miRNA在有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的胃癌組織中進行初步驗證。
　　結(jié)果:
　　1.通過qRT-PCR及Western Blot檢測結(jié)果表明:在實驗選取的六種不同類型的人胃癌細胞中均可檢測VEGF-C mRNA及蛋白的表達，但其中MKN-45中表達相對最低，而

6、SGC-7901中表達相對最高;
　　2.構(gòu)建VEGF-C過表達慢病毒載體，并對MKN-45細胞成功進行感染:熒光顯微鏡觀察其效率可達90％以上，且在基因及蛋白水平分別進行驗證;
　　3.淋巴管內(nèi)皮細胞管形成實驗顯示:收集實驗組、對照組和空白組細胞的培養(yǎng)上清，分別加入淋巴管內(nèi)皮細胞的培養(yǎng)體系中，觀察其小管的形成數(shù)目及小管長度分別也存在統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);
　　4.高通量microRNAs芯片:腫瘤誘導(dǎo)過的淋巴管

7、內(nèi)皮細胞和未處理的淋巴管內(nèi)皮細胞miRNA表達譜中發(fā)現(xiàn)89個miRNAs表達水平有顯著差異，其中47個miRNA表達上調(diào)，42個miRNA表達下調(diào);
　　5.應(yīng)用qRT-PCR方法鑒定RNA芯片篩選的部分miRNAs:通過對收集的有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移胃癌組織與無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移胃癌組織對比分析發(fā)現(xiàn)，miR-648，miR-5002-3p，miR-4754，miR-4760-5p，miR-4491，miR-4252，miR-5007-3p及miR