Ad-BMP-2基因修飾的骨膜細胞促進頜骨缺損修復的實驗研究.pdf

1、研究目的：
　　 1.探討從兔下頜骨骨膜和骨髓分離的兩種不同來源的間充質細胞在體外的生長特點和生物學功能的差異，為基因工程和組織工程篩選合適的種子細胞，為后續(xù)的實驗研究奠定基礎。
　　 2.探討腺病毒介導的骨形態(tài)發(fā)生蛋白2(Ad-BMP-2)基因轉染對體外培養(yǎng)的骨膜細胞和骨髓基質細胞的增殖以及向成骨細胞系分化的作用，觀察目的基因在兩種細胞內的表達情況，從而為基因治療選擇合適的靶細胞。
　　 3.探討腺病毒介導的骨

2、形態(tài)發(fā)生蛋白2(Ad-BMP-2)誘導兔下頜升支外側骨膜異位成骨的作用機制。
　　 4.探討多孔狀生物活性玻璃陶瓷(BGC)與體外培養(yǎng)擴增的兔骨膜細胞的生物相容性，為骨組織工程載體材料的選擇提供依據。
　　 5.探討腺病毒介導的骨形態(tài)發(fā)生蛋白2(Ad-BMP-2)基因修飾的骨膜細胞與生物活性玻璃陶瓷復合修復兔下頜骨臨界骨缺損的能力，并對基因修飾的組織工程化骨的作用機制進行初步探討。
　　 研究方法：
　　

3、 1.通過酶消化法分離培養(yǎng)骨膜細胞，密度梯度離心法分離骨髓基質細胞，體外對兩種細胞分別進行培養(yǎng)擴增。在體外對兩種細胞進行形態(tài)學觀察、增殖能力測定、克隆形成能力測定、ALP定性定量檢測以及體外礦化能力的檢測；在體內，將兩種細胞接種到自體背部肌袋內，6周后觀察異位骨形成效果。
　　 2.利用人胚腎293細胞擴增腺病毒，空斑形成試驗檢測病毒滴度；將Ad-BMP-2轉染骨膜細胞和骨髓基質細胞，原位雜交試驗測定目的基因的表達，酶聯免疫吸附

4、試驗(ELISA)測定轉染細胞目的蛋白的表達，噻唑藍比色法(MTT法)測定轉染細胞的增殖能力，酶動力學法測定堿性磷酸酶(ALP)活性，并對結果進行統(tǒng)計學分析。
　　 3.18只成年新西蘭大白兔按隨機化原則分成3組，每組6只，在一側下頜升支外側骨膜處注射0.2ml Ad-BMP-2(共含病毒滴度2×109pfu)作為實驗組，對側注射等量的PBS作為對照組，術后2、5、10周分別處死1組動物，行大體觀察、影像學和組織學檢查，觀察新骨

5、形成的時間和空間變化特點。
　　 4.體外培養(yǎng)并擴增兔骨膜細胞，運用MTT法和酶學測定法分別檢測BGC提取液對細胞增殖和堿性磷酸酶(ALP)活性的影響，運用倒置相差顯微鏡、掃描電鏡觀察與BGC復合培養(yǎng)的細胞在材料內的生長情況。
　　 5.將18只新西蘭大白兔按隨機化原則分成甲、乙兩組，每組9只，在每只兔雙側下頜骨體部制作10mm×6mm的矩形骨缺損，按植入物的不同分為4小組。A組：植入Ad-BMP-2基因修飾的組織工程化

6、骨(甲組右側)；B組：植入未經基因修飾的組織工程化骨(甲組左側)；C組：植入單純BGC材料(乙組右側)；D組：空白對照組(乙組左側)，保留缺損，未植入任何材料。術后4、8、12周分別處死甲、乙兩組3只動物，行大體觀察、影像學和組織學檢查，對各個時期的新骨形成的數量進行定量分析，并對結果進行統(tǒng)計學分析。
　　 結果：
　　 1.兩種不同來源的間充質細胞在體外均表現為成纖維細胞樣的外觀。在同等條件下，骨膜細胞的增殖能力要高于

7、骨髓基質細胞，但克隆形成率低于后者；骨膜細胞表達較高的ALP活性，骨髓基質細胞表達較低的ALP活性，前者是后者的3～4倍；在誘導培養(yǎng)液存在的條件下，在體外均能形成礦化結節(jié)，植入體內6周后均能分化形成骨樣組織，前者以骨膜化骨為主，后者以軟骨化骨為主。
　　 2.我們擴增的病毒滴度為5.5×1010pfu/ml；兩種細胞的轉染效率與病毒濃度有關，在感染復數為100時，轉染率均達95％以上；轉染第1d時即有目的蛋白的表達，在第5d時達

8、到高峰，分別為3126.3±150.5 pg/ml和3069.7±159 pg/ml，在體外功能蛋白的表達至少持續(xù)2周；基因轉染對細胞的增殖能力影響不大，甚至可以促進細胞的增殖；兩種轉染細胞分泌ALP的能力均明顯提高，這種作用與病毒濃度成正相關關系，基因轉染對骨髓基質細胞分泌ALP能力的影響高于對骨膜細胞的影響。
　　 3.Ad-BMP-2局部注射可以引起一定程度的炎癥反應，這種反應隨時間延長逐漸減弱；第2周時，注射區(qū)域的細胞開

9、始增殖和分化，有較多成纖維細胞樣細胞聚集；第5周時，類骨基質開始形成，部分區(qū)域開始礦化；第10周時，有編織骨和髓腔樣結構形成。骨化程度在不同個體間存在差異，骨化方式早期包括軟骨化骨和膜性化骨兩種方式，晚期以膜性化骨為主。而注射PBS側始終沒有新骨形成。
　　 4.BGC提取液對培養(yǎng)早期細胞的增殖有一定的抑制作用，對培養(yǎng)晚期細胞的增殖無明顯影響，在細胞培養(yǎng)過程中能上調骨膜細胞分泌ALP的能力；細胞在BGC材料孔隙表面生長增殖良好，

10、并能分泌細胞外基質。
　　 5.術后各組動物均生長良好，各實驗組均未出現急性免疫排斥反應。影像學顯示：第4周，A、B、C三個實驗組的移植材料與周圍骨組織均開始融合，邊界模糊。第8周，A組植入材料密度與周圍骨組織相近，交界線基本消失，B、C組密度略低。第12周，各實驗組與周圍骨組織完全融合，但材料密度仍以A組高。對照組始終存在骨缺損。組織學檢查結果：從第4周開始，A、B、C三組材料周邊空隙內均有較多的新骨形成，隨移植時間延長，新骨

11、量增多，礦化程度增高，在各個時間點，A組形成的新骨均高于B組(P<0.05)和C組(P<0.01)；而材料內部，A、B兩組均有新生骨組織形成，新生骨量相似(P>0.05)，明顯高于C組(P<0.05)。對于D組，缺損周邊有少量的新骨形成，大部分區(qū)域為纖維結締組織，12周時仍遺留明顯骨性缺損。
　　 結論：
　　 1.兩種不同來源的間充質細胞具有相似的細胞形態(tài)，但生物學功能存在差異，在適宜的刺激因素下均能向成骨細胞系分化，

12、提示下頜骨骨膜細胞也可以作為組織工程的良好的種子細胞來源之一。
　　 2.兩種轉染細胞均可以高效的表達目的基因和目的蛋白，Ad-BMP-2基因轉染可以促進細胞向成骨細胞系的分化，骨膜細胞和骨髓基質細胞均可以作為腺病毒載體轉染的良好的靶細胞。
　　 3.一定濃度的Ad-BMP-2可以誘導下頜升支外側骨膜和肌肉內的異位骨形成，增加皮質骨的厚度。
　　 4.在體外多孔狀BGC具有良好的細胞相容性，可以作為細胞載體應用于