Ad-BMP-2基因修飾的骨膜細(xì)胞促進(jìn)頜骨缺損修復(fù)的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、研究目的：
　　 1.探討從兔下頜骨骨膜和骨髓分離的兩種不同來源的間充質(zhì)細(xì)胞在體外的生長特點(diǎn)和生物學(xué)功能的差異，為基因工程和組織工程篩選合適的種子細(xì)胞，為后續(xù)的實(shí)驗(yàn)研究奠定基礎(chǔ)。
　　 2.探討腺病毒介導(dǎo)的骨形態(tài)發(fā)生蛋白2(Ad-BMP-2)基因轉(zhuǎn)染對體外培養(yǎng)的骨膜細(xì)胞和骨髓基質(zhì)細(xì)胞的增殖以及向成骨細(xì)胞系分化的作用，觀察目的基因在兩種細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)情況，從而為基因治療選擇合適的靶細(xì)胞。
　　 3.探討腺病毒介導(dǎo)的骨

2、形態(tài)發(fā)生蛋白2(Ad-BMP-2)誘導(dǎo)兔下頜升支外側(cè)骨膜異位成骨的作用機(jī)制。
　　 4.探討多孔狀生物活性玻璃陶瓷(BGC)與體外培養(yǎng)擴(kuò)增的兔骨膜細(xì)胞的生物相容性，為骨組織工程載體材料的選擇提供依據(jù)。
　　 5.探討腺病毒介導(dǎo)的骨形態(tài)發(fā)生蛋白2(Ad-BMP-2)基因修飾的骨膜細(xì)胞與生物活性玻璃陶瓷復(fù)合修復(fù)兔下頜骨臨界骨缺損的能力，并對基因修飾的組織工程化骨的作用機(jī)制進(jìn)行初步探討。
　　 研究方法：
　　

3、 1.通過酶消化法分離培養(yǎng)骨膜細(xì)胞，密度梯度離心法分離骨髓基質(zhì)細(xì)胞，體外對兩種細(xì)胞分別進(jìn)行培養(yǎng)擴(kuò)增。在體外對兩種細(xì)胞進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察、增殖能力測定、克隆形成能力測定、ALP定性定量檢測以及體外礦化能力的檢測；在體內(nèi)，將兩種細(xì)胞接種到自體背部肌袋內(nèi)，6周后觀察異位骨形成效果。
　　 2.利用人胚腎293細(xì)胞擴(kuò)增腺病毒，空斑形成試驗(yàn)檢測病毒滴度；將Ad-BMP-2轉(zhuǎn)染骨膜細(xì)胞和骨髓基質(zhì)細(xì)胞，原位雜交試驗(yàn)測定目的基因的表達(dá)，酶聯(lián)免疫吸附

4、試驗(yàn)(ELISA)測定轉(zhuǎn)染細(xì)胞目的蛋白的表達(dá)，噻唑藍(lán)比色法(MTT法)測定轉(zhuǎn)染細(xì)胞的增殖能力，酶動(dòng)力學(xué)法測定堿性磷酸酶(ALP)活性，并對結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
　　 3.18只成年新西蘭大白兔按隨機(jī)化原則分成3組，每組6只，在一側(cè)下頜升支外側(cè)骨膜處注射0.2ml Ad-BMP-2(共含病毒滴度2×109pfu)作為實(shí)驗(yàn)組，對側(cè)注射等量的PBS作為對照組，術(shù)后2、5、10周分別處死1組動(dòng)物，行大體觀察、影像學(xué)和組織學(xué)檢查，觀察新骨

5、形成的時(shí)間和空間變化特點(diǎn)。
　　 4.體外培養(yǎng)并擴(kuò)增兔骨膜細(xì)胞，運(yùn)用MTT法和酶學(xué)測定法分別檢測BGC提取液對細(xì)胞增殖和堿性磷酸酶(ALP)活性的影響，運(yùn)用倒置相差顯微鏡、掃描電鏡觀察與BGC復(fù)合培養(yǎng)的細(xì)胞在材料內(nèi)的生長情況。
　　 5.將18只新西蘭大白兔按隨機(jī)化原則分成甲、乙兩組，每組9只，在每只兔雙側(cè)下頜骨體部制作10mm×6mm的矩形骨缺損，按植入物的不同分為4小組。A組：植入Ad-BMP-2基因修飾的組織工程化

6、骨(甲組右側(cè))；B組：植入未經(jīng)基因修飾的組織工程化骨(甲組左側(cè))；C組：植入單純BGC材料(乙組右側(cè))；D組：空白對照組(乙組左側(cè))，保留缺損，未植入任何材料。術(shù)后4、8、12周分別處死甲、乙兩組3只動(dòng)物，行大體觀察、影像學(xué)和組織學(xué)檢查，對各個(gè)時(shí)期的新骨形成的數(shù)量進(jìn)行定量分析，并對結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
　　 結(jié)果：
　　 1.兩種不同來源的間充質(zhì)細(xì)胞在體外均表現(xiàn)為成纖維細(xì)胞樣的外觀。在同等條件下，骨膜細(xì)胞的增殖能力要高于

7、骨髓基質(zhì)細(xì)胞，但克隆形成率低于后者；骨膜細(xì)胞表達(dá)較高的ALP活性，骨髓基質(zhì)細(xì)胞表達(dá)較低的ALP活性，前者是后者的3～4倍；在誘導(dǎo)培養(yǎng)液存在的條件下，在體外均能形成礦化結(jié)節(jié)，植入體內(nèi)6周后均能分化形成骨樣組織，前者以骨膜化骨為主，后者以軟骨化骨為主。
　　 2.我們擴(kuò)增的病毒滴度為5.5×1010pfu/ml；兩種細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率與病毒濃度有關(guān)，在感染復(fù)數(shù)為100時(shí)，轉(zhuǎn)染率均達(dá)95％以上；轉(zhuǎn)染第1d時(shí)即有目的蛋白的表達(dá)，在第5d時(shí)達(dá)

8、到高峰，分別為3126.3±150.5 pg/ml和3069.7±159 pg/ml，在體外功能蛋白的表達(dá)至少持續(xù)2周；基因轉(zhuǎn)染對細(xì)胞的增殖能力影響不大，甚至可以促進(jìn)細(xì)胞的增殖；兩種轉(zhuǎn)染細(xì)胞分泌ALP的能力均明顯提高，這種作用與病毒濃度成正相關(guān)關(guān)系，基因轉(zhuǎn)染對骨髓基質(zhì)細(xì)胞分泌ALP能力的影響高于對骨膜細(xì)胞的影響。
　　 3.Ad-BMP-2局部注射可以引起一定程度的炎癥反應(yīng)，這種反應(yīng)隨時(shí)間延長逐漸減弱；第2周時(shí)，注射區(qū)域的細(xì)胞開

9、始增殖和分化，有較多成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞聚集；第5周時(shí)，類骨基質(zhì)開始形成，部分區(qū)域開始礦化；第10周時(shí)，有編織骨和髓腔樣結(jié)構(gòu)形成。骨化程度在不同個(gè)體間存在差異，骨化方式早期包括軟骨化骨和膜性化骨兩種方式，晚期以膜性化骨為主。而注射PBS側(cè)始終沒有新骨形成。
　　 4.BGC提取液對培養(yǎng)早期細(xì)胞的增殖有一定的抑制作用，對培養(yǎng)晚期細(xì)胞的增殖無明顯影響，在細(xì)胞培養(yǎng)過程中能上調(diào)骨膜細(xì)胞分泌ALP的能力；細(xì)胞在BGC材料孔隙表面生長增殖良好，

10、并能分泌細(xì)胞外基質(zhì)。
　　 5.術(shù)后各組動(dòng)物均生長良好，各實(shí)驗(yàn)組均未出現(xiàn)急性免疫排斥反應(yīng)。影像學(xué)顯示：第4周，A、B、C三個(gè)實(shí)驗(yàn)組的移植材料與周圍骨組織均開始融合，邊界模糊。第8周，A組植入材料密度與周圍骨組織相近，交界線基本消失，B、C組密度略低。第12周，各實(shí)驗(yàn)組與周圍骨組織完全融合，但材料密度仍以A組高。對照組始終存在骨缺損。組織學(xué)檢查結(jié)果：從第4周開始，A、B、C三組材料周邊空隙內(nèi)均有較多的新骨形成，隨移植時(shí)間延長，新骨

11、量增多，礦化程度增高，在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)，A組形成的新骨均高于B組(P<0.05)和C組(P<0.01)；而材料內(nèi)部，A、B兩組均有新生骨組織形成，新生骨量相似(P>0.05)，明顯高于C組(P<0.05)。對于D組，缺損周邊有少量的新骨形成，大部分區(qū)域?yàn)槔w維結(jié)締組織，12周時(shí)仍遺留明顯骨性缺損。
　　 結(jié)論：
　　 1.兩種不同來源的間充質(zhì)細(xì)胞具有相似的細(xì)胞形態(tài)，但生物學(xué)功能存在差異，在適宜的刺激因素下均能向成骨細(xì)胞系分化，

12、提示下頜骨骨膜細(xì)胞也可以作為組織工程的良好的種子細(xì)胞來源之一。
　　 2.兩種轉(zhuǎn)染細(xì)胞均可以高效的表達(dá)目的基因和目的蛋白，Ad-BMP-2基因轉(zhuǎn)染可以促進(jìn)細(xì)胞向成骨細(xì)胞系的分化，骨膜細(xì)胞和骨髓基質(zhì)細(xì)胞均可以作為腺病毒載體轉(zhuǎn)染的良好的靶細(xì)胞。
　　 3.一定濃度的Ad-BMP-2可以誘導(dǎo)下頜升支外側(cè)骨膜和肌肉內(nèi)的異位骨形成，增加皮質(zhì)骨的厚度。
　　 4.在體外多孔狀BGC具有良好的細(xì)胞相容性，可以作為細(xì)胞載體應(yīng)用于