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1、血友病 B是由凝血因子 IX(FIX)缺乏所引起的 X連鎖隱性遺傳性出血疾病,需終生治療,且費(fèi)用昂貴,因此人們希望通過(guò)基因治療來(lái)改善患者的癥狀。hFIX的表達(dá)不需要精確地調(diào)控,少量提高即可改善患者的出血癥狀,凝血因子的分泌無(wú)臟器特異性,因此血友病長(zhǎng)期以來(lái)被認(rèn)為是一種適合基因治療的疾病。
多數(shù)針對(duì)出生后的個(gè)體的基因治療,效果不佳,大多在短期內(nèi)FIX的表達(dá)就下降了。近年來(lái)的研究表明,干細(xì)胞宮內(nèi)移植(In Utero Stem Ce
2、ll Transplantation,IUSCT)是克服移植免疫排斥反應(yīng)的一種有效途徑。在胎兒的免疫系統(tǒng)尚未發(fā)育成熟時(shí),通過(guò)宮內(nèi)注射的方法將干細(xì)胞輸入到胎兒體內(nèi),使干細(xì)胞能在受體體內(nèi)歸巢并增殖分化,從而達(dá)到治療疾病的目的。干細(xì)胞作為基因的一種載體是研究的熱點(diǎn)之一,胚胎干細(xì)胞最具全能性,但由于倫理上的爭(zhēng)議限制了其使用。
人們?cè)谘蛩邪l(fā)現(xiàn)了具有干性的胎兒細(xì)胞,這些細(xì)胞具有類(lèi)似胚胎干細(xì)胞的功能,而沒(méi)有研究胚胎干細(xì)胞的倫理問(wèn)題。為了使
3、羊水細(xì)胞宮內(nèi)移植能應(yīng)用到臨床實(shí)踐,首先需在動(dòng)物體內(nèi)進(jìn)行宮內(nèi)治療的實(shí)驗(yàn)研究,通過(guò)建立羊水干細(xì)胞嵌合體動(dòng)物模型來(lái)探討干細(xì)胞在體內(nèi)的各種生物學(xué)特征和功能,為宮內(nèi)治療的實(shí)施奠定理論和技術(shù)基礎(chǔ)。
首先,我們通過(guò)富含各種生長(zhǎng)因子的培養(yǎng)液篩選貼壁的羊水細(xì)胞,再用機(jī)械分離的方法得到形態(tài)均一的羊水祖細(xì)胞(hAFPC),這種細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形,增殖速度快,并表達(dá)NANOG,SOX2,SSEA4和 TRA1-60等胚胎干細(xì)胞的特異性蛋白,經(jīng)誘導(dǎo)能成脂肪分
4、化和成骨分化。接著,我們構(gòu)建了hFIX和GFP共轉(zhuǎn)染的質(zhì)粒,以慢病毒系統(tǒng)轉(zhuǎn)染了羊水祖細(xì)胞后使用流逝細(xì)胞儀篩選出 GFP陽(yáng)性的細(xì)胞,進(jìn)一步培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn),羊水細(xì)胞能夠在mRNA水平表達(dá)hFIX和GFP,并且在細(xì)胞上清液中檢測(cè)到了持續(xù)穩(wěn)定表達(dá)的FIX蛋白,以及與之相應(yīng)的FIX活性。由此我們證實(shí)羊水祖細(xì)胞轉(zhuǎn)染了hFIX片段后能夠持續(xù)合成有凝血活性的 hFIX。應(yīng)用改良的宮內(nèi)移植注射器,我們將這種基因修飾的羊水祖細(xì)胞移植到12.5d的胎鼠腹腔中,嵌
5、合率達(dá)到50%以上。移植的細(xì)胞主要?dú)w巢到小鼠的肝臟和脂肪組織,其中肝臟中外源細(xì)胞的含量可達(dá)55.71±21.02%。出生3個(gè)月后仍能檢測(cè)到外源基因的表達(dá)。受體小鼠的外周血中我們也檢測(cè)到了高于1%的hFIX濃度,同樣可持續(xù)到出生后3個(gè)月。本研究為羊水來(lái)源的干細(xì)胞應(yīng)用于血友病B的產(chǎn)前治療提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ),也為宮內(nèi)治療遺傳性疾病提供新的途徑。轉(zhuǎn)染了hFIX基因的羊水祖細(xì)胞可能成為血友病B基因治療的新型細(xì)胞來(lái)源
本研究建立了分離和培養(yǎng)羊
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