10388.無選擇標(biāo)記基因修飾細(xì)胞模型的構(gòu)建與評(píng)價(jià)

1、分類號(hào)密級(jí)UDC編號(hào)碩士學(xué)位論文無選擇標(biāo)記基因修飾細(xì)胞模型的構(gòu)建與評(píng)價(jià)無選擇標(biāo)記基因修飾細(xì)胞模型的構(gòu)建與評(píng)價(jià)學(xué)位申請(qǐng)人：人：王志蕊王志蕊指導(dǎo)教師：師：董發(fā)明董發(fā)明教授教授畢延震畢延震研究員研究員學(xué)科專業(yè)：業(yè)：生物化學(xué)與分子生物學(xué)生物化學(xué)與分子生物學(xué)學(xué)位類別：別：理學(xué)理學(xué)2014年5月摘要I論文題目：論文題目：無選擇標(biāo)記基因修飾細(xì)胞模型的構(gòu)建與評(píng)價(jià)無選擇標(biāo)記基因修飾細(xì)胞模型的構(gòu)建與評(píng)價(jià)專業(yè)：業(yè)：生物化學(xué)與分子生物學(xué)生物化學(xué)與分子生物學(xué)研究

2、生：生：王志蕊王志蕊指導(dǎo)教師：指導(dǎo)教師：董發(fā)明董發(fā)明教授教授畢延震畢延震研究員研究員摘要本研究通過用豬腎PK15細(xì)胞作為細(xì)胞模型，分別構(gòu)建了功能性MSTN打靶載體和TALEN效應(yīng)蛋白表達(dá)載體，經(jīng)電穿孔轉(zhuǎn)染法將打靶載體導(dǎo)入豬腎PK15細(xì)胞，篩選獲得了一個(gè)能穩(wěn)定整合該載體、且EGFP表達(dá)均一的單克隆細(xì)胞。然后針對(duì)打靶載體ΔMSTN上錨定的LoxP位點(diǎn)，設(shè)計(jì)Cre重組酶表達(dá)載體(pTurboCre)，在MSTN打靶載體與TALEN表達(dá)載體轉(zhuǎn)入

3、豬腎PK15細(xì)胞，并篩選得到MSTN基因敲除單克隆細(xì)胞后，用CreLoxP重組系統(tǒng)敲除選擇標(biāo)記基因，評(píng)價(jià)該系統(tǒng)的基因刪除效率及定點(diǎn)置換率，為基因重組技術(shù)的研究利用提供新策略。通過流式篩選分析（FACS）、熒光定量PCR、TA克隆與測(cè)序等手段驗(yàn)證CreLoxP重組系統(tǒng)在豬細(xì)胞內(nèi)介導(dǎo)內(nèi)源性選擇標(biāo)記基因的刪除效率，并取得了以下研究結(jié)果：1.通過篩選得到了單克隆細(xì)胞系，這也驗(yàn)證了選擇標(biāo)記新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶和EGFP表達(dá)的有效性；在獲得單克隆細(xì)胞系

4、的基礎(chǔ)上通過CreLoxP介導(dǎo)的位點(diǎn)特異重組，驗(yàn)證了刪除內(nèi)源性選擇標(biāo)記表達(dá)框的可行性與效能。該單克隆細(xì)胞系的獲得，證明了打靶載體上的選擇標(biāo)記基因能夠有效表達(dá)，從而為檢測(cè)刪除反應(yīng)提供了一個(gè)良好的細(xì)胞模型。2.通過流式細(xì)胞儀測(cè)定各組總熒光表達(dá)強(qiáng)度GFPAMean水平。結(jié)果顯示，空白組Mock與陰性對(duì)照組Neg.Ctrl熒光峰值、峰形相當(dāng)，無明顯變化；CreloxP組熒光峰形變窄，熒光強(qiáng)度下降比較明顯。對(duì)各組熒光表達(dá)變化差異的分析結(jié)果顯示，C