GAD-,65-基因修飾神經(jīng)干細(xì)胞的構(gòu)建及其治療癲癇的初步應(yīng)用.pdf

1、癲癇是由多種病因引起的慢性腦功能障礙綜合征，是大腦神經(jīng)細(xì)胞群反復(fù)超同步放電引起的發(fā)作性、突然性、短暫性腦功能紊亂，是功能神經(jīng)外科的常見疾病。在臨床上約有20％-30％癲癇患者雖經(jīng)系統(tǒng)正規(guī)的抗癲癇藥物治療仍不能得到有效控制，成為難治性癲癇。傳統(tǒng)手術(shù)治療難治性癲癇的遠(yuǎn)期療效只有60％左右，而且并非所有難治性癲癇患者都適宜手術(shù)，特別是癲癇灶彌散或不明確者并不具備傳統(tǒng)手術(shù)的手術(shù)指征，因此有必要探索更安全、更有效的新治療方案。 癲癇發(fā)病機

2、制的一個核心環(huán)節(jié)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)興奮/抑制的失衡，主要是興奮性氨基酸神經(jīng)遞質(zhì)與抑制性氮基酸神經(jīng)遞質(zhì)平衡異常。在形態(tài)學(xué)上表現(xiàn)為癲癇灶內(nèi)抑制性神經(jīng)元(主要是γ-氨基丁酸能，如海馬齒狀回籃狀細(xì)胞)選擇性減少，癲癇灶內(nèi)神經(jīng)元上的抑制性突觸減少，與非癲癇灶相比，相差約50％，還有腦內(nèi)星形膠質(zhì)細(xì)胞增生，以及受累腦區(qū)膠質(zhì)化、腦組織萎縮等。因此用移植的方法增加γ-氨基丁酸能(gamma-aminobutyricacid，GABA)神經(jīng)元的數(shù)量，以恢復(fù)興奮

3、性神經(jīng)遞質(zhì)和抑制性神經(jīng)遞質(zhì)的平衡，可能將從根本上改變難治性癲癇的預(yù)后。隨著人們對“細(xì)胞分子神經(jīng)外科”觀念的普遍接受，近年關(guān)于細(xì)胞移植治療癲癇方面的研究已經(jīng)逐步開展，并取得了一定進(jìn)展。移植物主要是GABA能胚胎神經(jīng)細(xì)胞，谷氨酸脫羧酶(glutamicaciddecarboxylase，GAD)基因修飾的永生化神經(jīng)元，但是人類的胚胎腦組織來源很有限，并且面臨著倫理學(xué)束縛，應(yīng)用于臨床還不現(xiàn)實；普通神經(jīng)元不能分裂增殖，而永生化神經(jīng)元又存在致瘤性

4、，故都不能滿足臨床治療需求。鑒于神經(jīng)干細(xì)胞(neuralstemcells，NSCs)具有自我更新能力和多分化潛能，一定條件下可以分化成神經(jīng)系統(tǒng)的各種細(xì)胞，特別是移植到海馬區(qū)以后，有很高的神經(jīng)元分化率，因此在修復(fù)受損神經(jīng)組織以及神經(jīng)疾病基因治療等方面有良好的應(yīng)用前景；另外，神經(jīng)干細(xì)胞具有向病灶定向遷移的特點，使之特別適合作為彌漫性病變或隱匿性病變的基因治療載體。神經(jīng)干細(xì)胞尚未生長軸突和樹突，移植后可以與宿主細(xì)胞之間形成突觸，并有助于軸突

5、再生。 材料和方法1、神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)：取新生Sprague-Dawley大鼠，取海馬結(jié)構(gòu)，制備成單細(xì)胞懸液，以5×105/ml的細(xì)胞密度接種到培養(yǎng)瓶中，無血清培養(yǎng)，培養(yǎng)基如下：DMEM/F12，添加EGF20ng/ml，bFGF20ng/ml，2％B27添加劑。每2-3天換液，每7天傳代。 2、分析神經(jīng)干細(xì)胞團的懸浮穩(wěn)定性：懸浮穩(wěn)定性一般用沉降速率作為評價指標(biāo)；神經(jīng)干細(xì)胞團在具有一定粘滯性的培養(yǎng)基中懸浮，受到重力、浮力和

6、粘滯阻力的共同作用。通過檢測神經(jīng)干細(xì)胞團密度(ρ0)、神經(jīng)干細(xì)胞團半徑(r)、培養(yǎng)基密度(ρ1)、培養(yǎng)基粘滯系數(shù)(η)四個變量，可以確定神經(jīng)干細(xì)胞團在培養(yǎng)基中的沉降速率 (v=0.222gr2(ρ0-ρ1)/η)。在神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)過程中，通過對以上四個變量的動態(tài)檢測，以找出導(dǎo)致神經(jīng)干細(xì)胞團懸浮穩(wěn)定性改變的主要相關(guān)因素。 3、建立神經(jīng)干細(xì)胞抗貼壁培養(yǎng)方法：基于以上對神經(jīng)干細(xì)胞懸浮穩(wěn)定性的研究，本實驗試圖建立適合神經(jīng)干細(xì)胞穩(wěn)

7、定懸浮生長的抗貼壁培養(yǎng)方法，并檢測抗貼壁培養(yǎng)方法對細(xì)胞增殖分化的影響。實驗分3組：對照組和培養(yǎng)基修飾組、培養(yǎng)瓶修飾組。其中培養(yǎng)基修飾組是在培養(yǎng)基中添加5％甘露醇，使培養(yǎng)基密度和粘滯性增高；而培養(yǎng)瓶修飾組是在培養(yǎng)瓶底包被一層1.5％瓊脂糖凝膠，使細(xì)胞與培養(yǎng)瓶底壁隔離。通過BrdU摻入法檢測神經(jīng)干細(xì)胞S期標(biāo)記指數(shù)；通過MTT法檢測細(xì)胞活力；通過Nestin免疫細(xì)胞化學(xué)檢測神經(jīng)干細(xì)胞分化率。 4、克隆GAD65基因cDNA：根據(jù)Gen

8、Bank數(shù)據(jù)庫，結(jié)合pcDNA3.1(+)酶切位點，設(shè)計GAD65引物如下：上游引物：5’-AGTGAATTCAGAACCCATGGCATCTCC-3下游引物：5’-CGTCCAGCTCGAGCAAAGTGATTACAA-3。取成年Sprague-Dawley大鼠腦組織50mg，Trizol一步法抽提總RNA，電泳鑒定RNA完整性。以鼠腦組織總RNA為模板，以O(shè)ligo(dT)為引物，利用PromegaAccessRT-PCRSyste

9、m進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。以逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)產(chǎn)物為模板，以GAD65上下游引物引導(dǎo)，進(jìn)行PCR反應(yīng)，電泳初步鑒定PCR產(chǎn)物。 5、構(gòu)建重組真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3-GAD65：回收PCR產(chǎn)物目的片段，將目的片段連接到Pucm-T載體中，并測序鑒定。通過EcoRI和XhoI雙酶切，得到GAD65基因片段，將其插入到pcDNA3.1(+)的多克隆位點，酶切鑒定。InvitrogenHipurePlasmidMidi-prepareKit抽提純化重

10、組真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3-GAD65。 6、神經(jīng)干細(xì)胞基因轉(zhuǎn)染及表達(dá)分析：利用QiagenEffecteneTransfectionReagent介導(dǎo)，將pcDNA3-GAD65重組真核表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到神經(jīng)干細(xì)胞中，對照組神經(jīng)干細(xì)胞不進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染48小時以后，通過RT-PCR、WesternBlotting和免疫細(xì)胞化學(xué)檢測轉(zhuǎn)染效率和表達(dá)水平。并通過高效液相色譜法檢測轉(zhuǎn)染組和對照組神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)液GABA濃度，以評價GAD65

11、酶活性。 7、動物模型及細(xì)胞移植：移植前一天，在培養(yǎng)基中加入BrdU，以標(biāo)記神經(jīng)干細(xì)胞。60只成年Sprague-Dawley大鼠全部制作海人酸癲癇模型，并隨機分成三組：①GAD-NSC移植組(n=20)：癲癇模型，移植GAD65基因修飾神經(jīng)干細(xì)胞；②NSC移植組(n=20)：癲癇模型，移植普通神經(jīng)干細(xì)胞；③對照組(n=20)：癲癇模型，注射等體積生理鹽水。 8、檢測急性期癲癇發(fā)作：建模4-5小時，記錄癇性發(fā)作頻率(每小

12、時癇性發(fā)作次數(shù))。同時記錄右海馬-參考電極腦電圖，建模24小時以后，再次記錄腦電圖。腦電圖觀察評價方法：當(dāng)出現(xiàn)尖波、棘波、尖(棘)慢綜合波、多棘慢波時，判定為癇性放電；以癇性放電頻率(平均每小時癇性放電的次數(shù))為評價指標(biāo)。 9、小劑量戊四氮誘發(fā)試驗：建模1d，2d，3d，1w，2w，4w，8w等時間點，通過小劑量戊四氮(20mg/kg)誘發(fā)試驗檢測動物的癲癇敏感性。根據(jù)Racine分級標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評分。 10、檢測GAD65

13、基因體內(nèi)表達(dá)：建模1周后，每組各取大鼠5只，殺鼠取腦，分離海馬結(jié)構(gòu)，通過RT-PCR和WesternBlotting檢測GAD5基因體內(nèi)表達(dá)情況。 11、病理檢查：建模2月后，處死所有實驗動物，取腦組織，制成石蠟切片，HE染色病理檢查，同時給予針對BrdU和GAD65的免疫組化染色，以評價神經(jīng)干細(xì)胞存活狀況以及海馬結(jié)構(gòu)修復(fù)程度。 12、統(tǒng)計學(xué)方法：全部數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(-X±s)表示，采用SPSS10.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計

14、分析。數(shù)據(jù)組間比較采用方差分析，X2檢驗，Studentt檢驗，P＜0.05表示差異有顯著性意義。 結(jié)果神經(jīng)干細(xì)胞體外培養(yǎng)成功，但細(xì)胞團很快貼壁，傳代第6天全部細(xì)胞團均已嚴(yán)重貼壁。動態(tài)監(jiān)測發(fā)現(xiàn)，在神經(jīng)干細(xì)胞傳代培養(yǎng)過程中，神經(jīng)干細(xì)胞團半徑逐漸增大，而細(xì)胞團密度、培養(yǎng)基密度和粘滯系數(shù)均無顯著性差異，同時神經(jīng)干細(xì)胞團在培養(yǎng)基中的沉降速度快速增加，表明細(xì)胞團體積的增大是導(dǎo)致神經(jīng)干細(xì)胞團懸浮穩(wěn)定性改變的主要因素。 分子生物學(xué)實驗

15、：鼠腦總RNA抽提成功，RNA電泳見清晰的三個條帶，測OD值A(chǔ)260/280=1.72，提示RNA無明顯降解。RT-PCR成功擴增出目的基因cDNA，電泳顯示1.7kb大小的條帶。Pumc-GAD65測序結(jié)果與GenBank收錄的大鼠GAD65基因cDNA序列完全一致，無任何突變。重組真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3-GAD65構(gòu)建成功，酶切鑒定與預(yù)期一致。抽提純化質(zhì)粒，質(zhì)粒濃度高達(dá)0.8mg/ml。 神經(jīng)干細(xì)胞轉(zhuǎn)染試驗：神經(jīng)干細(xì)胞轉(zhuǎn)染

16、成功，48小時以后，RT-PCR和WesternBlotting表明轉(zhuǎn)染組神經(jīng)干細(xì)胞中目的基因表達(dá)豐度高，而對照組未出現(xiàn)對應(yīng)條帶。免疫細(xì)胞化學(xué)染色顯示轉(zhuǎn)染組GAD65(+)神經(jīng)干細(xì)胞占27.4％，對照組發(fā)現(xiàn)少量弱陽性細(xì)胞，陽性率為0.3％(P＜0.01)。轉(zhuǎn)染組神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)液GABA濃度為61072±826nmol/L；對照組神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)液GABA濃度為3540±166nmol/L，組間差異有高度顯著性(P＜0.01)。 動

17、物實驗：大鼠建模成功，所有實驗動物均出現(xiàn)癲癇發(fā)作。 2、通過RT-PCR，成功克隆大鼠GAD65基因，經(jīng)過測序鑒定，與GenBank數(shù)據(jù)庫的序列完全一致；成功構(gòu)建重組真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3-GAD65通過Effectene轉(zhuǎn)染試劑介導(dǎo)，將pcDNA3-GAD65導(dǎo)入神經(jīng)干細(xì)胞。RT-PCR、WesternBlotting、IHC均表明GAD65基因在神經(jīng)干細(xì)胞中表達(dá)豐度高，轉(zhuǎn)染組神經(jīng)干細(xì)胞分泌大量GABA。GAD65基因修飾神