NT-3修飾脫細(xì)胞脊髓支架的制備及治療脊髓損傷的實驗研究.pdf

1、背景:
　　隨著交通事故、外傷以及運(yùn)動性損傷的不斷增加,脊髓損傷呈逐漸上升的趨勢。脊髓損傷是由于多種原因造成的脊柱脫位或骨折等導(dǎo)致的脊髓受壓、水腫、出血、挫傷或斷裂,是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的一種嚴(yán)重創(chuàng)傷。脊髓損傷所致截癱,具有很高的致殘率,對社會對家庭的影響很大。目前,對全世界的科研工作者而言,治療脊髓損傷的方法仍在不斷探索之中。
　　目前脊髓損傷實驗性治療主要包括局部或整體的藥物治療,細(xì)胞移植的治療,基因工程技術(shù),理化治療以及新興

2、的組織工程治療。隨著組織工程技術(shù)在1987年在華盛頓的生物醫(yī)學(xué)小組會上提出至今,人們開始意識到組織工程技術(shù)是最有可能達(dá)到治療脊髓損傷目的的技術(shù)之一。近年來有文獻(xiàn)報道[1-2],支架材料、種子細(xì)胞以及促生長因子是組織工程的三要素,其中支架材料的構(gòu)建是關(guān)鍵。
　　所謂脊髓組織工程是指通過體外分離、培養(yǎng)相應(yīng)種子細(xì)胞,然后將一定數(shù)量的種子細(xì)胞種植到類似人體脊髓三維支架的生物材料上,繼續(xù)體外擴(kuò)增、培養(yǎng),形成細(xì)胞-生物材料復(fù)合物,再種植到相應(yīng)

3、脊髓節(jié)段上,最終形成具有一定結(jié)構(gòu)和功能的脊髓節(jié)段,從而達(dá)到治療脊髓損傷的作用?，F(xiàn)有的組織工程支架[3]包括以殼聚糖為代表的天然可降解支架,以聚乳酸聚羥基乙酸共聚體為代表的人工合成高分子材料支架,以及復(fù)合材料支架,他們或存在三維仿生結(jié)構(gòu)不足,或生物相容性欠佳等不足,限制了其在SCI再生修復(fù)中的應(yīng)用。近年來一種新的趨勢是采用天然脫細(xì)胞組織材料來構(gòu)建新型組織工程支架,并在構(gòu)建組織工程化心瓣膜[4]、角膜[5]、骨[6]、軟骨[7]、血管[8]

4、、皮膚[9]、膀胱[10]、肌肉[11]、周圍神經(jīng)[12]等方面已有廣泛應(yīng)用。
　　目的:
　　本課題組前期已初步制備出同種異體脫細(xì)胞脊髓支架[13],該支架具有如下優(yōu)勢:①保留了Ⅳ型膠原、纖維連接蛋白、層粘連蛋白等脊髓組織細(xì)胞外基質(zhì)成分,有利于細(xì)胞的粘附生長[14];②具有最接近脊髓組織的三維結(jié)構(gòu),能為軸突再生提供傷前相似的通道從而引導(dǎo)軸突正確生長[15];③具有良好的生物相容性,免疫原性微弱,可承載神經(jīng)干細(xì)胞生長、增殖[

5、16];④具有與正常脊髓相似的生物力學(xué)性能,適宜于體內(nèi)移植研究[13]。但該方案所制備脫細(xì)胞脊髓支架共需31小時,耗時較長,有學(xué)者表明[17],脫細(xì)胞組織即使在PBS中也會保持一個恒定的降解率,故前期方案仍有需改進(jìn)、優(yōu)化的地方。因此我們希望引入一種外界因素來優(yōu)化前期方案,使得優(yōu)化后的方案既能明顯縮短脫細(xì)胞時間,又能很好的達(dá)到脫細(xì)胞效果。
　　生物超聲處理技術(shù),即利用一定劑量的超聲能量及由之引發(fā)的聲空化效應(yīng)來影響物質(zhì)的結(jié)構(gòu)、狀態(tài)及特

6、性,或者強(qiáng)化某些物理、化學(xué)、生物過程,提高過程的質(zhì)量或效率。超聲波主要是通過其機(jī)械作用、熱效應(yīng)和空化效應(yīng)等對生物組織的細(xì)胞產(chǎn)生破壞作用,從而達(dá)到脫細(xì)胞的目的。有學(xué)者[18]通過反復(fù)凍融配合超聲振蕩洗滌成功制備出了豬脫細(xì)胞真皮基質(zhì)。將超聲脫細(xì)胞技術(shù)引入脫細(xì)胞脊髓制備方法中尚未見文獻(xiàn)報道。
　　基于這一理念,本研究擬在反復(fù)凍融、化學(xué)萃取、機(jī)械振蕩方法的基礎(chǔ)上引入超聲振蕩因素來構(gòu)建同種異體脫細(xì)胞脊髓支架并優(yōu)化脫細(xì)胞方案,既縮短脫細(xì)胞處理

7、時間又徹底去除細(xì)胞成分,進(jìn)一步完善支架的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。但是單純支架植入并不能改變移植區(qū)神經(jīng)營養(yǎng)因子匱乏的現(xiàn)狀,我們希望引入一種特定的神經(jīng)營養(yǎng)因子并將其整合到脫細(xì)胞脊髓支架當(dāng)中。大量文獻(xiàn)已經(jīng)表明NT-3對脊髓損傷修復(fù)的促進(jìn)作用,因此通過補(bǔ)充NT-3來治療脊髓損傷成為一種行之有效的方法[19-20]。故本研究擬通過一些列方法將NT-3整合到脫細(xì)胞脊髓支架當(dāng)中,并應(yīng)用復(fù)合NT-3的脫細(xì)胞脊髓支架等位移植修復(fù)大鼠脊髓全橫斷損傷,進(jìn)一步研究移植對

8、損傷區(qū)瘢痕形成的影響,損傷區(qū)神經(jīng)電生理傳導(dǎo)的影響以及與實驗大鼠后肢運(yùn)動功能恢復(fù)之間的相互關(guān)系。為后續(xù)開展脊髓損傷的基礎(chǔ)與臨床研究提供新思路、新方法和理論依據(jù),具有重要的科學(xué)意義和社會價值。
　　方法:
　　1、大鼠脫細(xì)胞脊髓支架制備方法改良的實驗研究
　　1.1、脫細(xì)胞優(yōu)化方案的確定:采用超聲振蕩、反復(fù)凍融、化學(xué)萃取以及機(jī)械振蕩綜合作用的方法制備脫細(xì)胞脊髓支架,并應(yīng)用大體形態(tài)學(xué)觀察、HE染色、及掃描電鏡觀察等方法檢測脫

9、細(xì)胞效果以確定最佳脫細(xì)胞方案。
　　1.2、脫細(xì)胞脊髓支架理化特性研究:通過掃描電子顯微鏡自帶軟件對經(jīng)優(yōu)化處理的脫細(xì)胞脊髓支架行孔徑大小檢測,采用液體置換法對脫細(xì)胞脊髓支架行孔隙率測定,并將干燥處理的正常脊髓組織與優(yōu)化方案處理后的支架對比測定該支架的含水率。
　　1.3、脫細(xì)胞脊髓支架降解特性研究:通過對優(yōu)化處理后的脫細(xì)胞脊髓支架行酶解率以及失重率測定,從而評價支架在體外模擬降解環(huán)境中的降解特性。
　　2、NT-3修飾

10、脫細(xì)胞脊髓支架的實驗研究:
　　將NT-3通過直接吸附法整合到脫細(xì)胞脊髓支架中,并通過藥物溶出儀處理,計算出該支架的載藥量及載藥率,為移植支架提供量化標(biāo)準(zhǔn)。
　　3、復(fù)合NT-3的脫細(xì)胞脊髓支架移植治療大鼠脊髓損傷的實驗研究:
　　將144只成年SD大鼠隨機(jī)分成4組,每組36只,雌雄不拘。其中A組為單純椎板切除組(陽性對照組),B組為脊髓全橫斷組(陰性對照組),C組為單純支架移植組,D組為復(fù)合NT-3支架移植組。在2周

11、、1月、2月、3月及6月分別對各組大鼠行BBB運(yùn)動評分、神經(jīng)電生理檢查、移植區(qū)脊髓大體形態(tài)學(xué)觀察、組織學(xué)觀察等。通過這一系綜合評定方法來評價復(fù)合NT-3的脫細(xì)胞脊髓支架對大鼠脊髓損傷的治療作用。
　　結(jié)果及結(jié)論:
　　1、大鼠脫細(xì)胞脊髓支架制備方法改良的實驗研究
　　1.1、用超聲振蕩、反復(fù)凍融、化學(xué)萃取以及機(jī)械振蕩的綜合方案能達(dá)到較好的脫細(xì)胞效果,且用時較前期方案少,該支架同樣具有良好的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu),細(xì)胞脫除徹底,細(xì)

12、胞外基質(zhì)保持較為完整。
　　1.2、通過優(yōu)化處理的脫細(xì)胞脊髓支架原有細(xì)胞成分被有效去除,具有94.57±3.45％的孔隙率和88.62±1.0%的含水率以及良好的三維空間結(jié)構(gòu)(平均孔徑為46μm),顯示出支架材料具有良好的結(jié)構(gòu)特性;
　　1.3、構(gòu)建的脫細(xì)胞脊髓支架在胰酶溶液中逐步降解,在第20h達(dá)到69.03±2.19%,在雙蒸水中逐步崩解,在第8天可達(dá)62.55±1.70%;
　　2、NT-3修飾脫細(xì)胞脊髓支架的實

13、驗研究:
　　NT-3能夠較為穩(wěn)定的復(fù)合到脫細(xì)胞脊髓支架中,并能使每克支架的NT-3載藥量達(dá)0.53±0.07μg,即支架的載藥率為0.53±0.07μg/g;
　　3、復(fù)合NT-3的脫細(xì)胞脊髓支架移植治療大鼠脊髓損傷的實驗研究:
　　BBB運(yùn)動評分中,在脊髓移植后2月、3月、6月時,D組略高于C組,但均高于B組并明顯低于A組(P<0.01)。C組、D組大鼠MEPN1波的潛伏期在2周、1月、兩月明顯短于B組而長于A組(