新型三維支架搭載LV-NT3修飾的雪旺氏細(xì)胞修復(fù)脊髓損傷的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、一、背景 脊髓損傷(spinal cord injury，SCI)是骨科臨床工作中最常見(jiàn)的創(chuàng)傷之一。隨著現(xiàn)代建筑業(yè)、交通運(yùn)輸業(yè)的發(fā)展，SCI的發(fā)生率也逐年呈上升趨勢(shì)。據(jù)報(bào)道，SCI在我國(guó)的年發(fā)生率約為60/100萬(wàn)。脊髓損傷常導(dǎo)致?lián)p傷節(jié)段平面以下感覺(jué)、運(yùn)動(dòng)功能不同程度的喪失，給病人帶來(lái)終生痛苦，給社會(huì)帶來(lái)巨大的損失和沉重的負(fù)擔(dān)，已成為世紀(jì)醫(yī)學(xué)挑戰(zhàn)之一。目前臨床上對(duì)脊髓損傷的治療主要有防治脊髓損傷后繼發(fā)性損害、保護(hù)殘存神經(jīng)元功能，

2、但是療效都不理想。這是由于損傷局部星形膠質(zhì)細(xì)胞增生形成膠質(zhì)疤痕，再生的神經(jīng)纖維無(wú)法穿越損傷區(qū)域，神經(jīng)再生困難，并且受損神經(jīng)元軸突由于缺少神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的趨化作用，失去正常的遷移能力從而阻礙軸突再生。 目前國(guó)內(nèi)外脊髓損傷修復(fù)的研究主要策略為促進(jìn)軸突再生、克服再生屏障。1981年Aguayo等通過(guò)大量實(shí)驗(yàn)證實(shí)脊髓的神經(jīng)軸突在合適的微環(huán)境中可以再生，是脊髓損傷修復(fù)研究的重要里程碑。隨著組織工程學(xué)的興起，脊髓損傷修復(fù)又取得了新的進(jìn)展。組織

3、工程技術(shù)治療SCI的基本模式為“種子細(xì)胞+生物分子+生物支架”。實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)經(jīng)過(guò)基因修飾的雪旺氏細(xì)胞(Schwann cells，SCs)，能分泌大量神經(jīng)生長(zhǎng)因子，誘導(dǎo)脊髓神經(jīng)元的再生，將生物可降解支架制成圓柱狀種植雪旺氏細(xì)胞一起移植修復(fù)脊髓損傷也取得了一定療效。 二、目的 1、建立體外原代培養(yǎng)雪旺氏細(xì)胞的方法，實(shí)現(xiàn)短時(shí)間內(nèi)獲得大量高純度雪旺氏細(xì)胞這一要求。 2、制作具有三維結(jié)構(gòu)的新型生物可吸收支架。 3、

4、構(gòu)建攜帶人神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)素3(homo sapiens neurotrophin3，hNT3)基因的慢病毒載體，將hNT3基因?qū)塍w外培養(yǎng)的SCs中，使其高效穩(wěn)定地表達(dá)hNT3。 4、通過(guò)將轉(zhuǎn)染hNT3基因的SCs種植到三維支架上，一起移植至脊髓半橫斷損傷處，觀察脊髓軸突再生及脊髓傳導(dǎo)功能恢復(fù)情況，探討新型三維支架搭載SCs移植對(duì)半橫斷脊髓損傷的修復(fù)作用。 三、研究方法 1、應(yīng)用植塊法與消化法相結(jié)合的方法進(jìn)行原代雪旺氏

5、細(xì)胞的培養(yǎng)。以新生SD大鼠的雙側(cè)坐骨神經(jīng)為材料，剝?nèi)ド窠?jīng)外膜，剪成1mm3大小的碎塊，用0.25％的胰蛋白酶和0.03％膠原酶消化，然后種植培養(yǎng)，培養(yǎng)基為含10％胎牛血清的DMEM，24小時(shí)后用阿糖胞苷去除成纖維細(xì)胞，共24小時(shí)，以后每2-3天更換培養(yǎng)液。 2、以PLGA為原料，通過(guò)熔融紡絲、拉升、編織等步驟制作新型三維可吸收支架，并進(jìn)行支架的體外、體內(nèi)生物相容性初步測(cè)試。 3、由Genebank中查得hNT3片段的基因

6、序列，合成引物后體外擴(kuò)增，構(gòu)建重組質(zhì)粒，接著進(jìn)行慢病毒載體的包裝。慢病毒包裝系統(tǒng)由pGC-El-EGFP載體、pHelper1.0載體，pHelper2.0載體三質(zhì)粒組成，以293T細(xì)胞為包裝細(xì)胞，在病毒攜帶的增強(qiáng)型綠色熒光蛋白的幫助下，檢測(cè)重組慢病毒的產(chǎn)生。 4、LV-hNT3轉(zhuǎn)染雪旺氏細(xì)胞，檢測(cè)慢病毒的轉(zhuǎn)染效率。然后進(jìn)行體內(nèi)實(shí)驗(yàn)。以雌性SD成鼠為動(dòng)物模型，將支架和轉(zhuǎn)染有hNT3的SCs植入大鼠半橫斷脊髓損傷處，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分

7、為A組：hNT3-SCs+三維支架，B組：SCs+三維支架，C組：三維支架。于術(shù)后2、4、8、12周，應(yīng)用BBB評(píng)分評(píng)價(jià)大鼠脊髓功能的恢復(fù)情況，使用HE、免疫組織化學(xué)染色、透射電鏡觀察等方法觀察雪旺氏細(xì)胞的存活、hNT3的表達(dá)、損傷處軸突的再生情況。 四、結(jié)果 1、經(jīng)S-100熒光染色鑒定雪旺氏細(xì)胞，結(jié)合Hoechst核染色后可計(jì)算出原代培養(yǎng)的細(xì)胞純度達(dá)95.2％，與文獻(xiàn)結(jié)果一致。 2、通過(guò)編織工藝成功研制了新型

8、三維支架，支架外徑3mm，微管道內(nèi)徑100μm，PLGA細(xì)絲直徑25μm，橫切面顯示中空微管內(nèi)徑均勻一致，呈螺旋上升排列。支架孔隙率為68％，支架具有具有良好的生物相容性，降解時(shí)間為3個(gè)月。 3、應(yīng)用本方法成功地獲得了高滴度的攜帶hNT3基因的重組慢病毒，病毒滴度達(dá)5×107TU/ml。 4、LV-hNT3對(duì)雪旺是細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染，結(jié)果顯示當(dāng)MOI值為10時(shí)轉(zhuǎn)染效率最高，可達(dá)85％。經(jīng)RT-PCR證實(shí)轉(zhuǎn)染的SCs中hNT3

9、mRNA的表達(dá)明顯高于對(duì)照組。 5、移植治療脊髓損傷后，術(shù)后4、8、12周，A組的BBB評(píng)分較其他組明顯提高(P＜0.05)，其中，A組好于B組，B組好于C組，HE染色觀察8周時(shí)脊髓材料交界處可見(jiàn)巨噬細(xì)胞和炎性細(xì)胞聚集，支架的表面有小炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，但較四周時(shí)少。12周時(shí)脊髓支架交界處巨噬細(xì)胞很少見(jiàn)，可見(jiàn)小的炎性細(xì)胞聚集，支架已經(jīng)完全吸收。移植術(shù)后3月的脊髓冰凍切面，可見(jiàn)脊髓移植物處有較多的雪旺氏細(xì)胞存活，術(shù)后4周的脊髓切片在熒光

10、顯微鏡下觀察到在脊髓損傷處有EGFP熒光表達(dá)，8周時(shí)，EGFP熒光表達(dá)數(shù)量較前減少，支架已開始吸收。12周時(shí)，仍有EGFP熒光表達(dá)，證明LV-hNT3轉(zhuǎn)染后在雪旺氏細(xì)胞內(nèi)持續(xù)穩(wěn)定的表達(dá)。12周時(shí)順標(biāo)和逆標(biāo)證實(shí)有新生的軸突穿越脊髓損傷區(qū)域。12周時(shí)經(jīng)Western Blotting檢測(cè)到hNT3得到了良好的表達(dá)。透射電鏡觀察：術(shù)后8周，有新的突觸形成，至術(shù)后12周，脊髓損傷處可見(jiàn)較多成簇的髓鞘，新生的無(wú)髓及有髓神經(jīng)纖維明顯增多。

11、五、結(jié)論 1.采用消化法與植塊法聯(lián)合應(yīng)用的方法，進(jìn)行SD新生鼠雪旺氏細(xì)胞的培養(yǎng)。能夠在短期內(nèi)快速獲得大量高純度的雪旺氏細(xì)胞，可作為種子細(xì)胞進(jìn)行SCI修復(fù)。 2.利用編織工藝制作的新型三維支架，具有良好的生物相容性和恰當(dāng)?shù)纳锝到鈺r(shí)間，適合修復(fù)SCI。 3.根據(jù)Genebank中hNT3序列體外擴(kuò)增了hNT3 cDNA，利用慢病毒三質(zhì)粒系統(tǒng)包裝生產(chǎn)了慢病毒LV-hNT3，病毒滴度達(dá)5×107TU/ml。 4