乳鼠雪旺氏細胞Sinerem體外標記和磁共振成像的實驗研究.pdf

1、由于脊髓容易受到各種生物和理化因素的損傷，而神經(jīng)細胞損傷后的再生能力極差，因而，一般認為，脊髓損傷（spinal cord injury，SCI）造成病人局部神經(jīng)功能損害甚至四肢癱瘓，表現(xiàn)為大小便失禁和損傷平面以下的感覺、運動等功能永久性缺失。SCI之后的功能缺失是主要是因為軸突受到破壞，神經(jīng)元和膠質(zhì)細胞死亡還有脫髓鞘變化等所致。而目前臨床上對SCI的治療缺少有效的方法，藥物治療主要應用大劑量的類固醇激素及支持療法等；外科治療主要是恢復

2、脊柱的穩(wěn)定性和椎管減壓手術(shù)等。 近年來，神經(jīng)干細胞移植的興起為SCI后的神經(jīng)功能修復提供了新的治療方法。新近的神經(jīng)細胞移植實驗表明細胞用于治療脊髓損傷療效明顯，細胞移植療法不僅替換了受損神經(jīng)細胞，還分泌了細胞生長必不可少的神經(jīng)因子并限制了膠質(zhì)瘢痕的生長，因而將種子細胞在體外擴增后進行細胞移植是目前修復脊髓損傷最有希望的手段之一。 雪旺細胞（Schwann cells，SCs）是構(gòu)成了周圍神經(jīng)髓鞘的重要細胞，SCs在外周神

3、經(jīng)再生中起關(guān)鍵作用。SCs作為種子細胞之一，取材方便，來源廣泛，遺傳性狀穩(wěn)定，是最前應用于SCI移植修復的細胞之一，已有部分實難表明，在脊髓損傷之后，位于周圍神經(jīng)系統(tǒng)的SCs可遷移到受損部位，參與脊髓修復的過程。此外，SCs具有許多功能，包括①分泌神經(jīng)營養(yǎng)因子如神經(jīng)生長因子，腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子，睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子等；②生產(chǎn)和釋放細胞外基質(zhì)分子，如層粘連蛋白； ③促進損傷后的軸突再生，引導軸突長進中央束并髓鞘化；④保護受損神經(jīng)元，改

4、善微循環(huán)。 而另一方面，細胞移植后如何在體內(nèi)轉(zhuǎn)歸仍然通過處死動物后行組織免疫學的方法確定，移植后細胞的存活，分布，遷移，分化無法得到無創(chuàng)的實時的有效的監(jiān)測，因而尚無法在臨床上進行評價。目前，得益于磁共振成像（MRI）的分子影像學的快速發(fā)展，細胞移植后的無創(chuàng)的活體示蹤成為可能。超小順磁性氧化鐵（USPIO）Sinerem作為一種新型的磁共振造影劑，已獲得FDA的批準，并已成功應用于多種細胞的標記。本課題組已將其應用于雪旺細胞SCs

5、的研究，并取得肯定的效果。而到目前為止，Sinerem對SCs的生物學影尚無系列的相關(guān)報道，本課題旨在體外通過多種方法研究標記前后的SCs的細胞活力，增殖能力以及凋亡等情況，力求探索標記SCs的適宜濃度，為SCs移植治療SCI模型的體內(nèi)實驗提供實驗依據(jù)及相關(guān)的技術(shù)參考。 第一部分 低濃度胰酶多次差速酶消培養(yǎng)和純化乳鼠雪旺細胞的實驗研究。 目的：觀察SCs體外培養(yǎng)，純化及傳代的情況，熟練掌握細胞培養(yǎng)技術(shù)，為下一步實驗奠定基

6、礎(chǔ) 方法：取新生3-5d的SD乳鼠，無菌條件下解剖后取出雙側(cè)臂叢及坐骨神經(jīng)，制成單細胞懸液后以3×105個/ml的細胞懸液接種于預鋪PLL過夜的25c㎡培養(yǎng)瓶中。用低濃度胰酶多次差速酶消純化SCs，在倒置的相差顯微鏡下觀察細胞的形態(tài)和數(shù)量等生長情況。采用免疫熒光法鑒定，P75NTR是SCs的細胞表面分子，利用其對SCs的特異性鑒別。 結(jié)果：SCs接種后，主要以單個圓形漂浮的細胞為主，少數(shù)細胞聚集成團塊狀；24 h后，大部

7、分細胞已貼壁，其中較多的細胞可見明顯的突起伸出，體積較小，可見細胞呈雙極狀，立體感較強：繼續(xù)培養(yǎng)，軸突變長，72h后細胞間軸突相連，相互纏繞交匯成網(wǎng)狀；同時可見另一種細胞，體積較大，形態(tài)不規(guī)則，色澤黯淡的細胞鋪在下面；用低濃度消化酶純化后細胞排列規(guī)則，緊密有序，或成直線，或相互平行，呈柵欄狀，紡綞狀或漩渦狀排列；細胞形態(tài)單一，只有極少數(shù)體積較大的扁平細胞。高倍鏡下可見SCs瘦長，胞體周圍有明亮的光暈，中間圓兩頭尖，兩側(cè)伸出兩個到三個長長

8、的軸突，細胞與細胞之間通過軸突相連。 P75NTR是特異性地標記SCs，在熒光顯微鏡下，陽性細胞被激發(fā)后發(fā)出紅色熒光。證實培養(yǎng)出來的細胞是特異性表達P75的細胞，免疫熒光可見P75的表達。 結(jié)論：乳鼠SCs能在體外進行培養(yǎng)和擴增，生長增殖能力較旺盛，能特異性地表達P75，是進行脊髓損傷修復的種子細胞之一。 低濃度胰酶多次差速酶消純化乳鼠SCs方法，無須添加特殊的試劑和藥物，操步驟相對比較簡單，實驗重復性強，提純

9、的SCs可達到95%以上，是一種安全快速，簡單有效的細胞培養(yǎng)方法。 第二部分 超小超順磁性氧化鐵Sinerem對大鼠雪旺細胞生物學活性影響。 目的：應用超小超順磁性氧化鐵（USPIO）Sinerem和轉(zhuǎn)染試劑多聚賴氨酸（PLL）復合物標記乳鼠雪旺細胞，初步評價Sinerem安全性及合適的標記濃度，為今后的進一步研究工作提供技術(shù)參考。 方法：取SD乳鼠坐骨神經(jīng)和臂叢神經(jīng)，用膠原酶消化后進行原代培養(yǎng)，并用超低濃度胰酶

10、提純，將制備的不同濃度的Sinerem-PLL復合物和雪旺細胞共孵育培養(yǎng)48h；細胞的生長情況通過倒置的相差顯微鏡觀察，氧化鐵顆粒在胞內(nèi)的存在通過普魯斯藍染色及透射電鏡證實，細胞周期及細胞凋亡通過流式細胞儀進行分析比較，細胞生長增殖影響通過CCK-8法檢測，細胞掃描用3.0T MR在體外進行數(shù)列分析。 結(jié)果：普魯士藍染色和透射電鏡觀察顯示細胞質(zhì)內(nèi)有鐵顆粒存在；CCK-8法檢測結(jié)果表明，100μg/ml～800μg/ml不同濃度范

11、圍的sinerem對細胞生長增殖的影響差異無統(tǒng)計學意義。流式細胞儀檢測結(jié)果顯示，500μg/ml的sinerem對細胞的生長周期及細胞凋亡和死亡的沒有明顯的影響。 結(jié)論： 1.不同濃度的Sinerem-PLL復合物可以用來體外標記乳鼠SCs。 2.隨Sinerem濃度的增高，其標記效率亦增高，且標記后T2 WI信號改變愈明顯。濃度在800μg/ml以下時，應用Sinerem-PLL復合物標記SCs安全、有效。