Ad-BDNF轉染體外培養(yǎng)乳鼠雪旺細胞的相關實驗研究.pdf

1、本論文包括文獻研究和實驗研究兩個部分。文獻研究通過大量的文獻資料,系統(tǒng)回顧了雪旺細胞體外培養(yǎng)的方法,并對重組腺病毒表達載體和腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子的研究進展進行總結和分析。通過分析既往雪旺細胞體外培養(yǎng)和基因轉染方法中存在的主要問題,設想將編碼神經(jīng)營養(yǎng)因子的基因片斷通過腺病毒載體導入雪旺細胞即可以實現(xiàn)目的基因的持續(xù)、穩(wěn)定表達,探索基因治療外周神經(jīng)損傷的新途徑。周圍神經(jīng)損傷后的修復與再生是多因子、多因素參與的生理過程,補充單一因子對神經(jīng)再生的作

2、用非常有限。周圍神經(jīng)損傷癥狀屬于祖國醫(yī)學中的痿癥和痹癥,且中藥正是一種多因素復合物,有可能提供更多、比例更接近神經(jīng)生理需求與生長活性因子的環(huán)境,有其獨特優(yōu)勢,此實驗的成功為日后結合傳統(tǒng)中醫(yī)的整體觀促進神經(jīng)損傷的恢復提供了良好的基礎。實驗研究目的:通過聯(lián)合運用多種方法在短時間內(nèi)獲得數(shù)量多、純度高的雪旺細胞,用攜帶腦源性神經(jīng)生長因子基因的重組腺病毒載體轉染雪旺細胞。探討應用重組腺病毒載體攜帶腦源性神經(jīng)生長因子基因轉染雪旺細胞的可行性及促進外

3、周神經(jīng)損傷恢復的有效途徑。方法:采取6-7 d SD乳鼠坐骨神經(jīng),利用酶消化法、差速貼壁法分離獲得雪旺細胞、Ara-C與G418聯(lián)合應用以去除成纖維細胞、牛腦垂體提取物(BPE)以促進雪旺細胞增殖,以及采用低濃度胰酶消化法傳代等一系列步驟,獲取大量高純度的雪旺細胞。為探討B(tài)PE對體外培養(yǎng)雪旺細胞增殖作用的影響以及確定BPE應用的最佳濃度,將第二代雪旺細胞分為五組,分別加入不同濃度的BPE(50μg/ml、100μg/ml、150μg/m

4、l、200μg/ml),并以不加BPE作為對照。在加入BPE后于第二、四、六、八天每組分別作S-100蛋白相關抗原免疫細胞化學染色,對雪旺細胞、成纖維細胞分別計數(shù),進行統(tǒng)計學分析。將重組腺病毒載體感染HEK293細胞,待CPE現(xiàn)象明顯時采用反復凍融法收獲病毒,然后將收獲的病毒再次感染HEK293細胞,收獲病毒,重復三次。對最后一次收獲的病毒采用噬斑檢測法(plaque assay)進行滴度測定。使用含有人BDNF基因的重組腺病毒載體,經(jīng)

5、不同感染復數(shù)(multiplicity of infection, MOI)病毒量感染體外培養(yǎng)的大鼠源性SC。RT-PCR和Western blot檢測感染后72 h的感染效率,進一步用高感染效率下的MOI病毒量感染SC, ELISA定量分析感染后3d、6d、9d、12d、15d、18d和21d時在感染后SC培養(yǎng)液上清中BDNF的表達。結果:經(jīng)形態(tài)學及S-100蛋白相關抗原免疫細胞化學染色鑒定證實所獲得的雪旺細胞狀態(tài)較好,純度較高,可達

6、90％以上。BPE對雪旺細胞有明顯促增殖作用;當BPE濃度為100μg/ml時,對成纖維細胞分裂影響較小同時對雪旺細胞保持了有效的促增殖作用。三輪病毒擴增后Ad-BDNF滴度為:1.78×109pfu/ml。重組腺病毒感染SC后72 h時,以MOI為200感染組的感染效率最高。進一步以MOI為200的病毒量感染SC,ELISA結果表明,在各時間點時,感染后SC培養(yǎng)液上清中的BDNF表達量均明顯高于正常SC。結論:通過將酶消化法、差速貼壁

7、法、Ara-C與G418、BPE及低濃度胰酶消化法聯(lián)合運用可以在短時間內(nèi)獲得純度高、狀態(tài)好的原代培養(yǎng)雪旺細胞。適當濃度的牛腦垂體提取物(BPE)可以有效的促進雪旺細胞增殖。使用HEK293細胞擴增腺病毒載體可以在短時間內(nèi)獲得高滴度的腺病毒載體。Ad-BDNF感染后SC能夠將重組腺病毒介導的外源性BDNF基因通過轉錄翻譯,最終表達的BDNF量高于正常SC,并且能夠維持較長時間。此為應用重組腺病毒載體攜帶腦源性神經(jīng)生長因子基因轉染雪旺細胞促