去細(xì)胞同種異體神經(jīng)種植雪旺細(xì)胞的體外實(shí)驗(yàn)觀察.pdf

1、目的：雪旺細(xì)胞和基底膜管在周圍神經(jīng)損傷后的神經(jīng)修復(fù)性再生中起著非常重要的作用。雪旺細(xì)胞作為神經(jīng)纖維內(nèi)主要的非神經(jīng)元活性細(xì)胞，具有神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)、趨化和使再生纖維成熟等重要功能?；啄す軇t能形成神經(jīng)再生的支架性三維空間從而起到接觸引導(dǎo)的作用。 由于胎兒組織尚未具有明顯的生物學(xué)特性，免疫系統(tǒng)處于不成熟狀態(tài)，對(duì)寄生環(huán)境有強(qiáng)烈依賴性，因此排斥反應(yīng)發(fā)生不明顯，容易導(dǎo)致“免疫寬容”。胎齡為28天的胎兔周圍神經(jīng)系統(tǒng)已經(jīng)發(fā)育成熟。因此，采用胎兔周圍神

2、經(jīng)培養(yǎng)雪旺細(xì)胞，既避免了自體雪旺細(xì)胞來(lái)源受限及自體神經(jīng)二次損傷又可避免細(xì)胞移植后產(chǎn)生的免疫反應(yīng)。已有的實(shí)驗(yàn)表明，最近發(fā)展的化學(xué)萃取方法可有效清除神經(jīng)中的雪旺細(xì)胞及髓鞘，從而減輕異體神經(jīng)的抗原性。而且，經(jīng)過(guò)化學(xué)萃取的異體神經(jīng)在去除抗原成分的同時(shí)還可保留其完整的纖維支架結(jié)構(gòu)和完整的基底膜。去細(xì)胞技術(shù)的發(fā)展為臨床尋找理想的自體神經(jīng)移植替代物開(kāi)辟了新的途徑。 本實(shí)驗(yàn)通過(guò)將胎兔雪旺細(xì)胞與經(jīng)去細(xì)胞處理的同種異體神經(jīng)橋接體經(jīng)體外結(jié)合培養(yǎng)，觀察

3、胎兔雪旺細(xì)胞在橋接體中的生長(zhǎng)情況并討論將胎兔雪旺細(xì)胞植入去細(xì)胞同種異體神經(jīng)橋接體制備組織工程化人工神經(jīng)修復(fù)周圍神經(jīng)缺損的可行性。為含雪旺細(xì)胞的去細(xì)胞同種異體神經(jīng)橋接復(fù)合體的體內(nèi)移植提供指導(dǎo)。 方法： 1.細(xì)胞培養(yǎng)：取懷孕28天的新西蘭白兔，耳緣靜脈注射空氣處死后迅速取胎兔。在手術(shù)顯微鏡下無(wú)菌條件下取胎兔坐骨神經(jīng)，盡量剝除神經(jīng)外膜及束膜。Hank's液沖洗5遍后將神經(jīng)剪碎。使用雙酶消化法(trypsin/collagena

4、se)培養(yǎng)雪旺細(xì)胞，培養(yǎng)過(guò)程中利用雙差速貼壁法及Arab-C(終末濃度10-5mmol/l)去除和抑制成纖維細(xì)胞后使用NGF(40ng/ml)促進(jìn)SC生長(zhǎng)。每日在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)情況； 2.去細(xì)胞神經(jīng)橋接體制備：取成年健康新西蘭白兔一只，分別自梨狀肌下緣水平以遠(yuǎn)切取雙側(cè)坐骨神經(jīng)，作為異體神經(jīng)的來(lái)源。神經(jīng)萃取前先在手術(shù)顯微鏡下去除表面的脂肪組織及部分神經(jīng)外膜，然后先置4℃蒸餾水中靜置6h，再將神經(jīng)段放入3％TritonX

5、-100中靜置12h，然后置蒸餾水中震蕩漂洗6h。如此反復(fù)，TritonX-100共作用時(shí)間為96h。對(duì)萃取的神經(jīng)段行石蠟切片HE染色，Laminin(層粘連蛋白)免疫組化染色及掃描電鏡觀察去細(xì)胞的情況； 3.雪旺細(xì)胞的植入：將培養(yǎng)好的原代SC以107/L的濃度用100ul的微量注射器注入去細(xì)胞神經(jīng)段中央，注射后置于細(xì)胞培養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)。分別與培養(yǎng)的1、3、5天通過(guò)石蠟切片HE染色觀察SC在橋接體中的生長(zhǎng)情況。 結(jié)論：采

6、用雙差速貼壁法去除絕大部分成纖維細(xì)胞后在細(xì)胞培養(yǎng)的初期使用Arab-C抑制成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)，后期培養(yǎng)液中加入NGF促進(jìn)雪旺細(xì)胞生長(zhǎng)能獲取大量雪旺細(xì)胞且純度可達(dá)90％以上。用3％TritonX-100作用96h可去除周圍神經(jīng)中的細(xì)胞和髓鞘而保留完整的神經(jīng)基底膜管和纖維支架結(jié)構(gòu)，并且對(duì)神經(jīng)基底膜主要成分-層粘連蛋白無(wú)明顯影響。采用胎兔坐骨神經(jīng)培養(yǎng)的雪旺細(xì)胞能在用成年兔坐骨神經(jīng)制備的去細(xì)胞橋神經(jīng)接體中生長(zhǎng)良好，并且有遷移成行的特性。種植胎兒雪旺