大鼠耳蝸雪旺細(xì)胞體外培養(yǎng)、純化及增殖的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、感音神經(jīng)性聾是臨床工作中最常見的疾病,其發(fā)病機(jī)理和治療方法仍在不斷的探索中,目前認(rèn)為主要病變部位在初級傳入螺旋神經(jīng)元(SGN)和耳蝸毛細(xì)胞。哺乳動物螺旋神經(jīng)元和耳蝸毛細(xì)胞損傷后幾乎不能再生,那么如何修復(fù)受損的SGN,如何使SGN增強(qiáng)在復(fù)雜的病理狀態(tài)下的修復(fù)能力,如何使SGN在損傷后的特殊微環(huán)境里提高其存活率是感音神經(jīng)性聾的研究方向之一。雪旺細(xì)胞是從胚胎時期周圍神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)嵴前體細(xì)胞演化而來的一種膠質(zhì)細(xì)胞。周圍神經(jīng)受損后其遠(yuǎn)端軸突和髓鞘

2、崩解,此時雪旺細(xì)胞可以大量增殖并且吞噬遠(yuǎn)端軸突和崩解的變性壞死的碎片。雪旺細(xì)胞還可以分泌神經(jīng)生長因子NGF和神經(jīng)營養(yǎng)因子NTF,因此雪旺細(xì)胞具有可以增加神經(jīng)元的存活率、促進(jìn)細(xì)胞軸突生長和提高神經(jīng)元再生的能力。
　　大量研究顯示,移植雪旺細(xì)胞能夠促進(jìn)脊髓、周圍神經(jīng)損傷的修復(fù)并具有加快中樞神經(jīng)系統(tǒng)脫髓鞘性疾病功能恢復(fù)的作用。然而,目前尚無關(guān)于耳蝸雪旺細(xì)胞和螺旋神經(jīng)元軸突的相互作用機(jī)制的研究報道和關(guān)于耳蝸雪旺細(xì)胞與外周神經(jīng)系統(tǒng)的其他雪旺

3、細(xì)胞之間的相似性和差異性的報道。而弄清楚以上問題的關(guān)鍵在于純化和定性耳蝸雪旺細(xì)胞。所以本研究致力于進(jìn)行大鼠仔鼠耳蝸雪旺細(xì)胞的體外培養(yǎng)、純化的試驗(yàn),并配制一種能使耳蝸雪旺細(xì)胞快速增殖的培養(yǎng)液配方。
　　實(shí)驗(yàn)一:大鼠耳蝸雪旺細(xì)胞體外培養(yǎng)和純化選用1-3d SD大鼠,無菌條件下暴露雙側(cè)聽泡,在高倍鏡下仔細(xì)剝離蝸殼,開放耳蝸,完整取出耳蝸組織,分離并且除去膜蝸管外側(cè)壁的血管紋和基底膜組織,然后剪碎。用0.25％的胰蛋白酶消化,用胎牛血清中

4、止消化,離心以后加入DMEM/F12培養(yǎng)液培養(yǎng)。3-5天后對細(xì)胞應(yīng)用免疫磁珠陽性分選方法進(jìn)行純化,培養(yǎng)2天后進(jìn)行傳代接種,培養(yǎng)過程中對提純后的大鼠耳蝸雪旺細(xì)胞進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察、并繪制其生長曲線,采用細(xì)胞免疫熒光染色對細(xì)胞進(jìn)行S-100免疫熒光鑒定并且計(jì)算細(xì)胞純度。結(jié)果:分離培養(yǎng)后所得的細(xì)胞即為雪旺細(xì)胞;利用免疫磁珠陽性分選法對培養(yǎng)所得的細(xì)胞進(jìn)行純化,純化后的大鼠耳蝸雪旺細(xì)胞純度為97％±1.2％。結(jié)論:免疫磁珠法是一種有效的分離純化新生大

5、鼠仔鼠耳蝸雪旺細(xì)胞的方法。所得雪旺細(xì)胞活力強(qiáng)、純度高,可以用于耳蝸雪旺細(xì)胞與螺旋神經(jīng)節(jié)軸突的生長和再生等相關(guān)研究。
　　實(shí)驗(yàn)二:耳蝸雪旺細(xì)胞增殖的試驗(yàn)取生長良好的第三代經(jīng)免疫磁珠分離純化的耳蝸雪旺細(xì)胞,消化后制成細(xì)胞濃度為1×104/ml的單細(xì)胞懸液,接種在96孔板上,每塊6×12孔,每孔加入200μl細(xì)胞懸液,共接種10個樣本。將硫酸乙酰肝素蛋白多糖HSPG和堿性成纖維細(xì)胞生長因子bFGF配置成不同濃度的的培養(yǎng)液。37℃,5％C

6、O2培養(yǎng),每日固定時間取一塊板,連續(xù)取10天,用激發(fā)波長為490nm的酶聯(lián)免疫測試儀測吸光度值,計(jì)算當(dāng)天各組A值均數(shù),以光吸收值為縱軸,時間為橫軸,繪制六組耳蝸雪旺細(xì)胞的生長曲線。
　　結(jié)果:B、C、D、E、F組優(yōu)于空白對照組A,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);B、C、D組之間無明顯差別,無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;E、F組優(yōu)于B、C、D組,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;E、F組之間無明顯差別,無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這說明用含硫酸乙酰肝素蛋白多糖HSPG和堿性成纖維細(xì)胞生