不同干預(yù)條件對大鼠胚胎肝干細胞體外培養(yǎng)影響的實驗研究.pdf

1、干細胞治療已成為目前國內(nèi)外生命科學(xué)研究的熱點之一。能夠應(yīng)用于治療的干細胞來源很多，其中胎肝中富含具有雙向分化潛能的干細胞，被認為是一個重要細胞來源。但由于某些原因如體外分離純化困難、增殖及分化機制不明等，限制了胎肝干細胞的臨床應(yīng)用。建立快捷、有效的提取方法，以及在培養(yǎng)中調(diào)控細胞高效增殖及誘導(dǎo)其定向分化一直是學(xué)者們努力的方向。優(yōu)化胎肝干細胞培養(yǎng)的方法，能夠為胎肝干細胞的臨床應(yīng)用研究奠定重要的基礎(chǔ)。
　　目的：
　　本研究擬探討

2、體外高效擴增大鼠胚胎肝干細胞的方法。根據(jù)細胞外誘導(dǎo)和細胞內(nèi)誘導(dǎo)可分為兩個部分：1、檢測可否通過沉默RhoA基因的方法優(yōu)化胎肝干細胞培養(yǎng)；2、研究不同濃度肝細胞生長因子（hepatocytegrowthfactor，HGF）和表皮生長因子（epidermalgrowthfactor，EGF）對大鼠胎肝干細胞體外增殖的影響，探索二者間有無協(xié)同作用。
　　方法：
　　1.將取自孕14天胎齡的F344大鼠胚胎肝組織的肝干細胞體外培養(yǎng)

3、，經(jīng)小分子干擾RNA（smallinterferingRNA，siRNA）轉(zhuǎn)染以沉默RhoA基因表達，分為3組：A：胎肝干細胞組；B：經(jīng)隨機打亂順序的siRNA轉(zhuǎn)染的胎肝干細胞組；C：經(jīng)特異siRNA轉(zhuǎn)染的胎肝干細胞組。用Westernblot及RT-PCR法檢測轉(zhuǎn)染前后胎肝干細胞RhoA的蛋白和基因表達。應(yīng)用四甲基偶氮唑藍比色法（MTT）觀察各組細胞生長情況，并采用流式細胞術(shù)測定各組細胞周期分布變化。
　　2.取孕14天胎齡F3

4、44大鼠胚胎的胎肝，經(jīng)三步分離法分離純化后，配置不同濃度HGF、EGF及HGF和EGF聯(lián)合組培養(yǎng)基，將胎肝干細胞分組培養(yǎng)。光鏡下觀察細胞增殖狀況，MTT法觀察不同濃度和不同時間HGF、EGF及HGF和EGF聯(lián)合對大鼠胎肝干細胞增殖的影響，并進行統(tǒng)計學(xué)分析。
　　結(jié)果：
　　1.RT-PCR顯示轉(zhuǎn)染特異siRNA組的胎肝干細胞RhoA基因表達量明顯降低（p<0.05），Westernblot顯示轉(zhuǎn)染特異siRNA組胎肝干細胞R

5、hoA蛋白表達量明顯降低（p<0.05），MTT結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染特異siRNA組的胎肝干細胞生長速度明顯增快，流式細胞術(shù)結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染特異siRNA組細胞處于G0/G1期的細胞減少，S期細胞數(shù)增多，各組間有統(tǒng)計學(xué)差異（p<0.05）。
　　2.HGF10～80ng/ml各濃度組，EGF10～80ng/ml各濃度組增殖效應(yīng)均大于對照組。當(dāng)HGF為20ng/ml，增殖效應(yīng)明顯大于對照組（p<0.01），當(dāng)HGF濃度繼續(xù)增高時，增殖效應(yīng)無明顯

6、增高。將20ng/mlHGF組與不同濃度EGF組合后分組培養(yǎng)細胞，發(fā)現(xiàn)20ng/mlHGF和10ng/mlEGF聯(lián)合組增殖效應(yīng)明顯升高，繼續(xù)升高聯(lián)合組中EGF濃度，增殖效應(yīng)無明顯提高。
　　結(jié)論：
　　1.通過siRNA干擾的方法可以有效的沉默RhoA基因并促進大鼠胎肝干細胞增殖，對其培養(yǎng)有優(yōu)化作用。
　　2.HGF和EGF具有明顯改善大鼠胎肝干細胞體外無血清培養(yǎng)條件的作用，二者對大鼠胎肝干細胞體外培養(yǎng)具有協(xié)同促進作用