原兒茶醛對(duì)大鼠心肌干細(xì)胞體外增殖的影響.pdf

1、目的：
　　原兒茶醛（PCA），是從中藥丹參中提取的一種水溶性單體，具有較強(qiáng)的抗缺氧能力，和擴(kuò)張冠狀動(dòng)脈，增加冠血流量的療效。本實(shí)驗(yàn)擬選取適宜的培養(yǎng)條件及操作方法，成功從SD大鼠心臟中分離出純度高、生物活性好的CSCs，研究不同濃度PCA對(duì)大鼠CSCs體外增殖作用的影響，以及PCA促進(jìn)CSCs體外增殖，與P i3k-Akt信號(hào)通路調(diào)控細(xì)胞周期進(jìn)程的關(guān)系，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)提供理論依據(jù)。
　　方法：
　　選用1-3日齡的SD大鼠

2、，酶消化的方法分離培養(yǎng)出心肌干細(xì)胞，第二代CSCs與不同濃度的PCA（0.16 mM，0.42 mM，1.26 mM，3.78 mM和11.34 mM）共培養(yǎng)，24h，48h，72h后用MTT比色法檢測(cè)PCA對(duì)CSCs的影響；不同濃度的PCA（0.42mM，1.26mM，3.78 mM）與CSCs共培養(yǎng)24 h，C-kit熒光抗體標(biāo)記，流式細(xì)胞儀測(cè)定c-k it+的干細(xì)胞的比率，最終確定出 PCA的最佳給藥劑量和時(shí)間；通過(guò) C-kit熒

3、光抗體標(biāo)記，流式細(xì)胞儀分選的方法，進(jìn)一步提高 c-kit+CSCs的比率，選取純化后的第二代CSCs，用C-kit和K i-67熒光抗體分別標(biāo)記細(xì)胞膜和細(xì)胞核，免疫熒光鑒定的方法檢測(cè)c-kit+CSCs的純化； PCA與純化后的CSCs共培養(yǎng)24 h，流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞周期不同階段所含 CSCs的比率；RT-qPCR法檢測(cè)細(xì)胞周期進(jìn)程相關(guān)基因的表達(dá)，即Pi3k，Akt，CyclinD，CDK4，Ki-67，PCNA的mRNA的表達(dá)水平，

4、以及干細(xì)胞相關(guān)基因C-kit和Sca-1的mRNA的表達(dá)；進(jìn)一步采用Western Blot免疫印跡實(shí)驗(yàn)考察基因Pi3k，Akt1和PCNA蛋白表達(dá)水平。
　　結(jié)果：
　　經(jīng)過(guò)消化分離的心臟組織，3d之后，成纖維樣細(xì)胞逐漸從組織塊兒的邊緣逸出，并逐漸相互交聯(lián)形成細(xì)胞層。1周后，可見(jiàn)一些小、圓、亮的細(xì)胞附著在成纖維細(xì)胞層上。收集纖維層上小細(xì)胞，經(jīng)過(guò)傳代培養(yǎng)，細(xì)胞呈現(xiàn)出棒狀梭型，且形態(tài)均一，延長(zhǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)時(shí)間，CSCs聚集交融，逐

5、漸形成類(lèi)似于太陽(yáng)形狀的集落。
　　MTT法檢測(cè)表明，與對(duì)照組相比，PCA作用后的CSCs生長(zhǎng)增殖迅速，24h后，當(dāng)PCA的濃度為0.16mM，0.42mM，1.26mM，3.78mM和11.34mM時(shí)，CSCs增殖具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05 or P<0.01)，48 h的檢測(cè)結(jié)果與24 h的相似，72 h后，當(dāng)PCA的濃度為0.42mM，1.26mM，3.78mM時(shí)，CSCs增殖具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05 or P<0.01

6、)，但是，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，CSCs的增殖程度降低。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)顯示，0.42mM，1.26 mM和3.78 mM的PCA與細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，c-k it+CSCs比率達(dá)到19.6％，41.0%和17.6%，與空白組6.9%相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。
　　細(xì)胞周期分析的結(jié)果顯示，在S期，0.42mM，1.26 mM和3.78 mM作用過(guò)的CSCs的細(xì)胞比率分別為10.27±2.61%，22.44±2.77%和9.

7、00±2.56%，與對(duì)照組5.11±2.89%相比，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05 or P<0.01)；在G2/M期，0.42 mM，1.26 mM和3.78 mM作用過(guò)的CSCs的細(xì)胞比率分別為8.72±2.57%，2.56±1.88%和7.34±2.87%，與對(duì)照組5.54±2.61%相比，0.42mM和3.78 mM組具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05），1.26mM組細(xì)胞比率顯著低于對(duì)照組；在G0/G1期，0.42 mM，1.26 m

8、M和3.78 mM作用過(guò)的CSCs的細(xì)胞比率分別為81.07±3.39%，73.99±3.00%和83.67±3.21%，與對(duì)照組89.35±3.22%相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05 or P<0.01)。
　　RT-qPCR結(jié)果顯示，1.26 mM組的P i3k的表達(dá)水平，以及0.42 mM，1.26 mM，3.78mM組的Akt、CyclinD、CDK4的表達(dá)水平，與空白組 CSCs相比顯著上調(diào)(P<0.05 or P

9、<0.01)；1.26mM組的Sca-1的表達(dá)水平，和3.78mM組的PCNA的表達(dá)水平，以及0.42mM，1.26 mM，3.78 mM組的C-k it及K i-67的表達(dá)水平，與空白組CSCs相比顯著上調(diào)(P<0.05 or P<0.01)。
　　Western Blot免疫印跡結(jié)果顯示，0.42mM，1.26mM，3.78mM的PCA作用于CSCs后，Pi3k蛋白和PCNA蛋白的表達(dá)水平顯著上調(diào)（P<0.05 or P<0.

10、01），Akt1蛋白的表達(dá)水平，在0.42mM和1.26 mM的PCA組顯著上調(diào)（P<0.05 or P<0.01），但是在3.78mM的PCA作用下，Akt1蛋白的表達(dá)水平下調(diào)。
　　結(jié)論：
　　在新生的SD大鼠心肌組織中，存在有C-kit+CSCs，且CSCs在體外能夠自我更新和分裂增殖； PCA可促進(jìn)CSCs的體外增殖； PCA可上調(diào)Pi3k，Akt，CyclinD， CDK4，C-kit，Sca-1，Ki-67和PC