糖尿病大鼠骨髓內皮祖細胞體外培養(yǎng)的實驗研究.pdf

1、研究背景：糖尿病是一種以高血糖為主要表現(xiàn)的代謝性疾病，高血糖能誘發(fā)血管病變而致器官組織缺血。內皮祖細胞（endothelial progenitor cells，EPCs）是血管新生的前體細胞，可促進血管新生和側枝循環(huán)的建立，為缺血性疾病的治療提供了新材料。但體內獲取的EPCs數(shù)量不足及糖尿病本身對EPCs數(shù)量和功能的影響制約了EPCs在臨床的應用。本研究力圖通過建立糖尿病大鼠模型，探討糖尿病對EPCs的影響及EPCs在體外擴增的適宜條

2、件，為EPCs的臨床應用提供理論基礎。
　　 第一部分糖尿病大鼠模型制作
　　 目的：本實驗選用鏈脲佐菌素（STZ）誘導糖尿病動物模型，探索一種安全、長期穩(wěn)定性好、動物死亡率低的糖尿病模型建立方法。
　　 方法：健康Wistar大鼠40只，隨機分為A、B兩組，每組20只。兩組給藥前均禁食不禁水12小時，A組為一次給藥法組，即按50mg/kg經(jīng)腹腔快速注射新鮮配置的STZ（10mg/ml）。B組采取兩次快速給藥法，

3、第1次給藥，按10mg/kg經(jīng)腹腔快速注射新鮮配置的STZ（10mg/ml），24小時后第2次給藥，按50mg/kg再次經(jīng)腹腔快速注射新鮮配置的STZ（10mg/ml）。72h后測空腹血糖值，以空腹血糖>16.7mmol/L作為造模成功的標準。
　　 結果：A組72小時內死亡1只，72h測空腹血糖2只未成模，2周后死亡1只，死亡率10％，16只達到糖尿病模型標準，成模率80％；B組72小時內死亡1只，72h后測空腹血糖有1只未成

4、模，第5天死亡2只（其中1只為未成模大鼠），2周后死亡1只。死亡率20％，16只達到糖尿病模型標準，長期成模率80％（2個月）。
　　 小結：
　　 1.STZ單次給藥與兩次給藥比較，成模率及死亡率均無差別。
　　 2.應用STZ制備糖尿病模型，是一種安全、長期穩(wěn)定性好、動物死亡率低的方法。
　　 第二部分正常大鼠骨髓內皮祖細胞的培養(yǎng)及鑒定
　　 目的：在正常大鼠EPCs培養(yǎng)時加入不同濃度的重組人

5、粒細胞集落刺激因子（rhG-CSF）和重組人紅細胞生成素（rhEPO），通過監(jiān)測EPC數(shù)量及功能的變化，來探討rhG-CSF、rhEPO在EPCs體外擴增中的作用，尋求促進EPC體外擴增的適宜條件。
　　 方法：健康Wistar大鼠10只，乙醚吸入麻醉下斷頸處死，取脛骨及股骨骨髓，密度梯度離心法分離單個核細胞，NH4CL消化殘留紅細胞，加入含有20％胎牛血清、VEGF20ng/ml，bFGF10ng/ml的低糖DMEM培養(yǎng)液中，

6、接種于鋪有纖維連接蛋白的培養(yǎng)板中，72小時后換液洗去末貼壁細胞，以后3天換液一次，細胞培養(yǎng)第7天，用0.25％胰蛋白酶消化細胞，爬片，免疫組化測定細胞表型（CD34、CD133、Flk-1）；同時以等數(shù)量細胞接種于96孔板，隨機分為分成對照組、rhG-CSF組和rhEPO組（CK組、G組和E組），rhG-CSF組根據(jù)濃度不同又分為（G1組、G2組、G3組、G4組），rhEPO組根據(jù)濃度不同又分為（E1組、E2組、E3組、E4組），分別加

7、入rhG-CSF和rhEPO的濃度為（8ug/L、40ug/L、200ug/L、1000ug/L）、（20IU/L、100IU/L、500IU/L、2500IU/L），繼續(xù)培養(yǎng)24h，觀察細胞數(shù)量和粘附功能。
　　 結果：
　　 1.使用密度梯度離心法和NH4CL消化法獲得的骨髓單個核細胞含有具有內皮分化潛能的內皮祖細胞，在適宜的培養(yǎng)條件下可以實現(xiàn)內皮祖細胞的體外擴增。
　　 2.重組人粒細胞集落刺激因子、重組人

8、促紅細胞生成素均對EPCs培養(yǎng)起到積極作用，1000ug/L的rhG-CSF與500IU幾的rhEPO兩組對活細胞數(shù)量、貼壁細胞數(shù)量的促進作用最好。
　　 小結：
　　 1.內皮祖細胞可以在適宜的培養(yǎng)條件下進行體外培養(yǎng)、純化和擴增，提示內皮祖細胞可以通過體外擴增的方法滿足臨床治療需要。
　　 2.重組人粒細胞集落刺激因子、重組人促紅細胞生成素可以通過劑量依賴的方式促進體外培養(yǎng)內皮祖細胞的數(shù)量和功能，具有此方面潛在

9、的臨床應用價值。
　　 第三部分糖尿病大鼠骨髓內皮祖細胞的培養(yǎng)及鑒定
　　 目的：通過對比正常大鼠、糖尿病未控制血糖大鼠及糖尿病控制血糖大鼠三組骨髓內皮祖細胞體外培養(yǎng)的不同，探討糖尿病及高血糖對骨髓內皮祖細胞的影響；通過研究促紅細胞生成素（EPO）對體外培養(yǎng)內皮祖細胞的數(shù)量及功能變化的影響，探討EPO的應用價值。
　　 方法：Wistar大鼠30只，分為A、B、C三組，每組10只。A組為正常大鼠，B組為糖尿病未控

10、制血糖大鼠，C組為糖尿病控制血糖正常大鼠（胰島素治療）。細胞培養(yǎng)具體步驟同第二部分，細胞培養(yǎng)第7天，0.25％胰蛋白酶消化搜集貼壁細胞，爬片做免疫組化（具體步驟同第二部分），三組細胞每組隨機分為不加藥組（加入等量的PBS液）和加藥組（加入500IU/L的rhEPO），以同等密度接種于96孔板，比較細胞數(shù)目與粘附功能。
　　 結果：
　　 1.對于內皮祖細胞的數(shù)量和功能，糖尿病大鼠控制血糖正常組與正常大鼠組無顯著性差異（p

11、>0.05），而兩者與糖尿病大鼠未控制血糖組相比均有顯著性差異（p<0.05），糖尿病大鼠組內皮祖細胞數(shù)量與功能下降。
　　 2.在體外培養(yǎng)體系中加入EPO，對正常大鼠及糖尿病大鼠的內皮祖細胞細胞生長均有積極作用。
　　 小結：
　　 1.糖尿病高血糖可影響內皮祖細胞體外培養(yǎng)的數(shù)量和功能，提示血糖控制對于在糖尿病個體中獲取做夠數(shù)量和功能的內皮祖細胞至關重要。
　　 2.重組人促紅細胞生成素（rhEPO）能

12、夠對正常大鼠、糖尿病大鼠內皮祖細胞體外培養(yǎng)起到積極作用，提示其有此方面的應用價值。
　　 結論：
　　 1.應用STZ成功地建立了糖尿病動物模型。
　　 2.重組人粒細胞集落刺激因子、重組人促紅細胞生成素可以通過劑量依賴的方式促進體外培養(yǎng)內皮祖細胞的數(shù)量和功能，而且重組人促紅細胞生成素也糖尿病大鼠內皮祖細胞體外培養(yǎng)起到積極作用，提示具有此方面潛在的臨床應用價值。
　　 3.糖尿病高血糖可影響內皮祖細胞體外