臍血內皮祖細胞治療糖尿病大鼠下肢缺血的研究.pdf

1、目的:糖尿病并發(fā)癥是威脅人類健康的世界性公共衛(wèi)生問題。糖尿病血管并發(fā)癥發(fā)病率高,其中周圍血管病變所致下肢缺血可致足潰瘍,甚至截肢,是糖尿病致殘的重要因素,給病人及家屬帶來極大的痛苦及負擔。糖尿病下肢缺血發(fā)病機制復雜,目前認為主要因為是動脈粥樣硬化同時伴側支循環(huán)受損,其中側支血管能力形成受損占重要地位。近年來的大量研究表明內皮祖細胞(EPC)在血管形成中起重要作用。正常情況下循環(huán)EPC的相對數(shù)量較少,而在創(chuàng)傷或缺血時顯著增加。但糖尿病患者

2、EPC增殖能力遠低于非糖尿病患者,且與活化內皮細胞的粘附、增殖以及形成小血管的能力下降,缺血組織對外源性生長因子反應性也降低。臍血中存在內皮祖細胞,其數(shù)目高于同等量外周血,取材無創(chuàng)傷,易找到HLA相合的供者,可長期保存。使用臍血內皮祖細胞治療糖尿病血管病變是一個值得研究的領域,但目前國內外尚缺乏此方面的實驗研究。故本研究采用鏈脲佐菌素(STZ)建立糖尿病模型,結扎大鼠雙后肢股動脈形成下肢缺血,應用射線照射減輕大鼠排斥反應,抽取足月產婦臍

3、血,分離臍血單核細胞,培養(yǎng)細胞7天,獲得內皮祖細胞,經尾靜脈注射或者局部肌肉注射,將內皮祖細胞移植入大鼠。熒光示蹤內皮祖細胞,觀察大鼠雙后肢潰瘍變化情況,通過對腓腸肌中Ⅷ因子與VEGF表達的研究,探討臍血內皮祖細胞治療糖尿病下肢缺血的效果及方法。方法:1、臍血內皮祖細胞的分離、培養(yǎng)及鑒定:取產婦足月產臍血50 ml,運用密度梯度離心法分離獲得單核細胞,利用內皮祖細胞貼壁的生長特性,培養(yǎng)細胞7天,貼壁生長細胞即含內皮祖細胞。將培養(yǎng)細胞消化

4、,‘用細胞表達因子(CD133,CD34,KDR)經流式細胞儀鑒定內皮祖細胞,并計數(shù)活細胞數(shù),達到移植有效活細胞數(shù)。2、糖尿病大鼠模型的建立及分組:將20只體重約200～250 g的健康雄性Wistar大鼠常規(guī)喂養(yǎng)一周后,隨機選取15只給予一次性腹腔注射鏈脲佐菌素(STZ)55 mg/kg復制糖尿病模型,5只正常大鼠給予檸檬酸緩沖液等容量注射作為正常對照組。上述大鼠分為四組:①糖尿病股動脈結扎后經尾靜脈注射EPC治療組(Diabetes

5、+ligation+intravenous injection,DLV):上述糖尿病大鼠射線照射后結扎雙后肢股動脈,復制缺血模型,再經尾靜脈注射EPC,觀察經尾靜脈注射EPC治療后下肢缺血的療效。②糖尿病股動脈結扎后局部肌肉注射EPC治療組(Diabetes+ligation+intramuscular injection,DLM):糖尿病大鼠射線照射后結扎雙后肢股動脈,右后肢局部注射EPC,觀察缺血局部肌肉注射EPC治療后下肢缺血的療

6、效。左后肢局部注射等體積磷酸鹽緩沖液(PBS)作為糖尿病股動脈結扎治療的對照組(Diabetes+ligation+control,DLC)。③糖尿病未處理組:糖尿病不結扎不注射EPC(Diabetes control withoutEPC injection and ligation,DC)。④正常大鼠股動脈結扎后經尾靜脈EPC移植治療組(Normal+ligation+intravenous injection,NLV):正常血糖大

7、鼠射線照射后結扎雙后肢股動脈,尾靜脈注射EPC。3、各組大鼠進行如下實驗:①熒光示蹤內皮祖細胞:用GFP(綠色熒光)在內皮祖細胞注射前轉染內皮祖細胞,轉染成功后移植入大鼠,一周后取腓腸肌組織作冰凍切片,觀察有無熒光表達并對比熒光強度,示蹤內皮祖細胞是否到達缺血部位。②腓腸肌HE染色與Ⅷ因子免疫組化染色觀察毛細血管數(shù):注射內皮祖細胞后21天,處死大鼠,無菌操作取腓腸肌,固定,脫水,石蠟包埋,行HE染色和Ⅷ因子的免疫組化染色,通過觀察肌纖維

8、間毛細血管數(shù)情況了解內皮祖細胞治療后側支循環(huán)有無改善,內皮祖細胞治療糖尿病下肢缺血的療效。③RT-PCR檢測雙后肢腓腸肌VEGF mRNA表達:注射內皮祖細胞后21天,處死大鼠,無菌操作取腓腸肌,行RT-PCR檢測VEGF mRNA表達,從基因水平研究內皮祖細胞治療糖尿病下肢缺血的療效。4、統(tǒng)計學處理:應用SPSS13.0統(tǒng)計軟件分析數(shù)據(jù),計量資料以均數(shù)±標準差((x)±s)表示,DLC組與DLM組、DLV組、NLV組、DC組間應用單因

9、素方差分析及SNK-q檢驗,DLV組與DLM組間使用配對設計均數(shù)比較t檢驗,P<0.05表示統(tǒng)計學有意義。結果:1、分離的臍血內皮祖細胞的鑒定:流式細胞儀測定培養(yǎng)7天細胞CD34含量最高,CD133次之,KDR含量最少,提示為早期內皮祖細胞。2、大鼠一般情況及大鼠雙后肢缺血變化情況:與正常大鼠比較,糖尿病組在注射STZ兩天后開始出現(xiàn)明顯多飲、多尿、毛發(fā)干枯。結扎股動脈后到21天處死期間,注射內皮祖細胞的后肢,其缺血及潰瘍愈合較未注射內皮

10、祖細胞后肢改善明顯,愈合速度加快。尾靜脈注射肢與局部注射肢改善差別不明顯。糖尿病大鼠與正常大鼠潰瘍恢復無明顯差別。3、內皮祖細胞的熒光示蹤情況:注射內皮祖細胞腓腸肌中有熒光表達,熒光亮度強,尾靜脈注射與局部注射熒光亮度相似；DLC組腓腸肌中有熒光表達,但很少；DC組腓腸肌無熒光表達。4、腓腸肌HE染色與Ⅷ因子免疫組化染色情況:各組每低倍鏡視野毛細血管數(shù)均值:DLC(4.75±0.957),DLM(18.5±8.737),DLV(18.7

11、5±4.349),NLV(21±2.944),DC(17±3.162)。注射內皮祖細胞與DC組腓腸肌中毛細血管數(shù)多于DLC組腓腸肌中毛細血管數(shù),分布密集,其差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；尾靜脈注射與局部注射相比毛細血管數(shù)無明顯差別(P>0.05)。5、VEGF mRNA的表達情況:各組VEGF mRNA2-△△CT均值:DLC(1.029±0.293),DLM(2.707±0.946),DLV(2.621±0.414),NLV(3.

12、121±1.734),DC(3.414±0.677)。糖尿病注射EPC(DLM、DLV組)、正常尾靜脈注射EPC(NLV組)以及糖尿病未結扎股動脈未注射EPC(DC組)大鼠腓腸肌VEGF表達較糖尿病結扎股動脈未注射EPC(DLC組)腓腸肌增高,其差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),尾靜脈注射與局部注射肢腓腸肌VEGF表達無明顯差異(P>0.05)。糖尿病大鼠尾靜脈注射與正常大鼠尾靜脈注射無明顯區(qū)別(P>0.05)。結論:1、臍血內皮祖細胞