人臍帶血干細胞移植治療糖尿病鼠下肢缺血的研究.pdf

1、目的: 本研究在比較羥乙基淀粉沉淀法和Ficoll淋巴細胞分離液法制備臍帶血單核細胞基礎(chǔ)上，采用免疫磁珠分選人臍血CD34+細胞，建立一種能夠方便獲得高純度人臍血CD34+細胞的方法；同時在體外培養(yǎng)擴增該細胞，擴增前后的細胞進行鑒定，進一步了解CD34+細胞的特性，為其臨床應(yīng)用創(chuàng)造條件。 方法: 取足月妊娠、正常分娩的新鮮臍血，隨機分配到實驗組和對照組；實驗組采用羥乙基淀粉法，對照組采用Ficoll淋巴細胞分離液法收集單個核細胞

2、(MNC)。兩組均使用MidiMACS免疫磁性吸附性分選裝置，采用CD34+細胞陽性正選法，進行CD34+細胞的分選與純化，之后應(yīng)用包含干細胞因子(SCF)，血小板生成素(TPO)，粒細胞集落刺激因子(G—CSF)的無血清培養(yǎng)液，進行7天體外培養(yǎng)擴增；在顯微鏡下動態(tài)觀察細胞生長的情況，應(yīng)用流式細胞儀檢測擴增前后細胞CD34+細胞的純度和表面標(biāo)志。 結(jié)果: 共采集臍血20份，實驗組與對照組平均體積為110.2±25.2mlvs10

3、8.1±21.1ml，統(tǒng)計分析無顯著性差異。實驗組與對照組獲得單核細胞數(shù)為(5.15±1.17)×109和(4.13±1.03)×109，雖然后者少于前者，但是兩者相比統(tǒng)計學(xué)無顯著性差異(p=0.053)。兩組分離的CD34+細胞數(shù)，實驗組多于對照(6.25±1.11)×109和(4.04±0.66)×109，統(tǒng)計學(xué)分析有顯著性意義(p<0.05)。MidiMACS分選的CD34+細胞的純度實驗組為97.23±3.3％，對照組為96.2

4、3±2.3％，兩組間統(tǒng)計學(xué)無顯著性差異。兩組細胞活力無差別，臺盼藍拒染細胞活力達96％以上。經(jīng)過細胞因子培養(yǎng)后實驗組擴增倍數(shù)為7.43±0.90，對照組擴增倍數(shù)為7.06±1.01，兩組進行t檢驗無顯著差異(p=0.403)。培養(yǎng)后的CD34+細胞進行流式細胞儀鑒定，表明細胞表面CD133、CD117均有表達。 結(jié)論: 羥乙基淀粉結(jié)合免疫磁珠分選的方法在獲得高純度CD34+細胞中有重要的意義。應(yīng)用包含細胞生長因子的無血清培養(yǎng)液可

5、以體外擴增CD34+細胞。 目的: 通過高脂飲食和鏈脲佐菌素(STZ)腹腔注射結(jié)合制備BALB/C裸鼠糖尿病模型，觀察其血糖及胰腺病理學(xué)改變；建立糖尿病裸鼠的下肢缺血模型，觀察下肢缺血變化。 方法: 8—9周齡雄性BALB/C裸鼠，隨機分為四組，Ⅰ組給予高脂飲食4周后注射鏈脲菌素(30mg/kg)共飼養(yǎng)8周(n=10)，Ⅱ組普通飲食4周后注射鏈脲菌素(30mg/kg)共飼養(yǎng)8周(n—10)，Ⅲ組高脂飲食8周(n=10)，

6、Ⅳ組正常對照組普通飲食4周后注射等量檸檬酸鈉緩沖液(n=10)。其中Ⅰ組和Ⅳ組在8周后制作下肢缺血模型。測定小鼠血脂、血糖、糖耐量，制作胰腺切片，觀察其形態(tài)學(xué)變化；選取Ⅰ組和Ⅳ組裸鼠，游離左下肢股動脈及大隱動脈、旋髂外動脈及股動脈肌支共四處，分別用3/0號線結(jié)扎后切斷，并且將下肢主干動脈包括脛腓動脈予以抽剝，制作下肢缺血模型，觀察肢體血運，溫度，病理等變化。 結(jié)果: 注射STZ4周后Ⅰ組裸鼠血糖、總膽固醇均顯著高于空白組；形態(tài)學(xué)

7、觀察發(fā)現(xiàn)，Ⅰ組胰腺病理HE染色可見胰島淀粉樣沉積、散在分布、形狀不規(guī)則，對照組未出現(xiàn)類似變化。制作成功下肢缺血模型后觀察，在糖尿病組肢體缺血情況重，壞死范圍多，非糖尿病組多是局限于腳趾的壞死，缺血下肢皮膚的顏色較健康側(cè)加深，壞死范圍沒有糖尿病組大。糖尿病組小鼠下肢缺血自我恢復(fù)慢，兩組從第7天開始就出現(xiàn)差別，統(tǒng)計分析7天、14天和28天的時候糖尿病組血流恢復(fù)慢，兩組間采用重復(fù)測量的方差分析檢驗有顯著性差異p<0.05。HE染色普通光學(xué)顯微

8、鏡下檢查可見正常裸鼠的骨骼肌肌纖維排列整齊，肌節(jié)清晰可見；Ⅳ組裸鼠骨骼肌肌纖維排列較紊亂，肌間質(zhì)部分纖維化，Ⅰ組即糖尿病組的紊亂更加明顯，肌肉萎縮，肌間質(zhì)部分纖維化。 結(jié)論: 高脂飲食和STZ腹腔注射結(jié)合可用于糖尿病鼠模型的制作，與人類2型糖尿病代謝特征相似，是研究人類糖尿病血管病變較理想的動物模型。在糖尿病模型基礎(chǔ)上制作下肢無主干及其分支動脈供血的缺血模型，更接近于重癥下肢缺血的臨床實際情況。 目的: 研究經(jīng)過培養(yǎng)擴增

9、的臍帶血干細胞移植入糖尿病性下肢缺血模型裸鼠肢體后對缺血恢復(fù)的促進作用；研究TGF-β1和CD105在干細胞移植中的變化及意義。 方法: 分離臍帶血CD34+細胞，進行體外培養(yǎng)，并且制備糖尿病裸鼠下肢缺血模型；用Dil標(biāo)記培養(yǎng)后的干細胞和單核細胞；動物分組：Ⅰ組移植經(jīng)過培養(yǎng)的CD34+的臍帶血干細胞(n—10)，Ⅱ組移植從臍帶血分離的單核細胞(n=10)，Ⅲ組注射相同體積的PBS+0.1％BSA(n＝10)；在細胞培養(yǎng)7天后，將

10、6.68×105/個細胞注射到缺血肢體，此時為缺血模型制作成功后3天；采用激光多普勒血流灌注測量移植前，移植后3、7、14、28天檢測三組溫度變化，免疫組化檢側(cè)毛細血管密度。在移植后12小時和28天時每組分別取5只進行實時定量逆轉(zhuǎn)錄—多聚酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)和Westernblotting檢測TGF-β1和CD105在細胞移植后的變化。 結(jié)果: 經(jīng)過標(biāo)記的細胞在Ⅰ組中可以觀察到，移植細胞聚集在肌束周圍。Ⅲ組中沒有發(fā)現(xiàn)標(biāo)記細胞

11、，Ⅱ組中有少量標(biāo)記的移植細胞發(fā)現(xiàn)。從第14天開始，Ⅰ組的溫度恢復(fù)明顯好于Ⅱ組和Ⅲ組，統(tǒng)計學(xué)分析有顯著性差異p<0.05。在Ⅰ組血管密度明顯增多。Ⅱ組亦有新生血管，密度大于Ⅲ組，明顯小于Ⅰ組，Ⅲ組中血管密度改變較小。Ⅰ組中有人源的單克隆抗體HNA表達。細胞移植后12小時，TGF-β1mRNA和CD105mRNAⅠ組高于Ⅱ組和Ⅲ組，Ⅱ組和Ⅲ組相比，前者較后者有增高，均有統(tǒng)計學(xué)意義(p<0.05)，28天時各組間無明顯差異。Westernbl

12、otting檢測移植后12小時TGFβ1和CD105蛋白，Ⅰ組明顯高于Ⅱ組和Ⅲ組，Ⅱ組高于Ⅲ組，差異有顯著性(p<0.05)。28天，檢測TGFβ1和CD105蛋白的變化發(fā)現(xiàn)，Ⅰ組TGF-β1明顯高于Ⅱ組和Ⅲ組，統(tǒng)計學(xué)分析有顯著性差異(p<0.05)，Ⅱ組和Ⅲ組相比，統(tǒng)計學(xué)分析無顯著性差異。 結(jié)論: 移植培養(yǎng)擴增的臍帶血干細胞可以改善糖尿病裸鼠缺血局部的皮溫、增加缺血局部的血管密度、促進缺血恢復(fù)；缺血組織中TGF-β1和CD10