胰腺干細(xì)胞移植治療1型糖尿病的動物實驗研究.pdf

1、研究背景 糖尿病是影響人類健康的主要疾病之一。其治療方法包括傳統(tǒng)藥物、胰島素注射以及胰腺器官移植和胰島移植等。胰腺器官移植技術(shù)復(fù)雜，圍手術(shù)期并發(fā)癥發(fā)生率較高，手術(shù)適應(yīng)證仍局限于糖尿病合并腎功能衰竭需同時行胰腎聯(lián)合移植者，目前僅在世界上比較大的移植中心開展。以胰島移植為代表的細(xì)胞替代治療具有手術(shù)易操作，創(chuàng)傷小的優(yōu)點；而且與胰島素注射治療相比，胰島移植物對機(jī)體血糖可實時監(jiān)控，并及時釋放胰島素，維持機(jī)體的血糖穩(wěn)定狀態(tài)，防止糖尿病腎病、

2、視網(wǎng)膜病變等并發(fā)癥的發(fā)生。1999年埃德蒙頓(Edmonton)方案的實施使胰島移植的療效得到了顯著提高，標(biāo)志著糖尿病治療進(jìn)入了現(xiàn)代胰島移植的全新階段。但胰島移植同樣面臨著供體來源受限的問題，加上移植圍手術(shù)期技術(shù)和環(huán)境改變等因素造成的胰島細(xì)胞大量死亡和功能損害，最終限制了胰島移植在臨床更大范圍的應(yīng)用。故擴(kuò)大胰島細(xì)胞來源成為近年胰島移植研究領(lǐng)域的熱點。有學(xué)者曾嘗試采用異種胰島移植(如豬)解決胰島供體不足的矛盾，并且認(rèn)為有可能避免1型糖尿病

3、的自身免疫性攻擊，但由于存在豬源性逆轉(zhuǎn)錄病毒感染的潛在危險，目前多數(shù)科學(xué)家認(rèn)為只有在掌握人獸共患病機(jī)制之后，此項技術(shù)才能開展。 為解決胰島移植供體短缺的難題，近年來干細(xì)胞成為研究的熱點之一。干細(xì)胞最顯著的生物學(xué)特征是既具有自我更新、高度增殖的能力，又具有多向分化的潛能。按其來源可將它們分為胚胎干細(xì)胞(Embryonic stem cells，ESCs)和成體干細(xì)胞(Adult somatic stem cells，ASSCs)。

4、胰腺干細(xì)胞(Pancreatic stem cell，PSCs)屬于ASSCs，目前還沒有明確的定義。一般是指未達(dá)終末分化狀態(tài)，能產(chǎn)生胰島組織或起源于胰島，具有自我更新復(fù)制能力的未定型細(xì)胞。PSCs由于與胰腺內(nèi)分泌細(xì)胞屬于同一細(xì)胞譜系，分化成目標(biāo)細(xì)胞的生物學(xué)步驟最短，被認(rèn)為是最有希望作為臨床胰島移植的干細(xì)胞來源之一。其它優(yōu)點包括：(1)具有高度增殖和多向分化潛能，能極大解決胰島細(xì)胞來源不足的難題；(2)可通過胰腺活檢獲得自身的PSCs、

5、干細(xì)胞建庫、基因工程改造或修飾同種異體PSCs的方法避免或降低免疫排斥反應(yīng)的發(fā)生；(3)避免了ESCs引起的無限增值而導(dǎo)致的腫瘤生長；(4)避免了應(yīng)用ESCs帶來的社會倫理問題。目前已有較多的研究對PSCs的細(xì)胞來源、培養(yǎng)、體外誘導(dǎo)分化、鑒定等進(jìn)行了探討。由于PSCs的研究尚處于起步階段，各種方法差別較大，還沒有一套公認(rèn)的的培養(yǎng)、誘導(dǎo)分化及鑒定方案。另外，由于體外條件下無法模擬促使干細(xì)胞發(fā)育成熟的體內(nèi)環(huán)境，致使大多數(shù)研究不能獲得真正成熟

6、的胰島細(xì)胞，不能夠完全逆轉(zhuǎn)動物的高血糖狀態(tài)。因此，我們設(shè)計本實驗，確立一種簡單有效的培養(yǎng)、鑒定PSCs的方案；鑒于體內(nèi)微環(huán)境有促進(jìn)PSCs發(fā)育成熟的刺激信號、營養(yǎng)物質(zhì)和因子，我們也試圖尋找促使PSCs發(fā)育成熟的最佳體內(nèi)環(huán)境，也就是使PSCs發(fā)揮最佳的治療糖尿病的效果。 目的： (1)探索從新生Wistar大鼠胰腺組織中分離、培養(yǎng)胰腺干細(xì)胞并進(jìn)行鑒定以及體外誘導(dǎo)分化的方法。 (2)探討并比較不同分化狀態(tài)的胰腺干細(xì)胞

7、(未分化細(xì)胞和經(jīng)體外誘導(dǎo)方案誘導(dǎo)分化的細(xì)胞)經(jīng)兩種移植途徑(分別經(jīng)門靜脈和腎包膜下移植)對糖尿病大鼠的治療效果。 方法： (1)取新生Wistar大鼠的胰腺組織，經(jīng)膠原酶消化成組織碎片，轉(zhuǎn)入含有RPMI1640高糖培養(yǎng)基(含33.3mM的Glu，并添加了10％FBS、20ng/ml EGF，20ng/ml bFGF)的培養(yǎng)瓶(預(yù)先用鼠尾膠原處理)中進(jìn)行原代和傳代培養(yǎng)；使用無血清RPMI1640低糖培養(yǎng)基(含11.1mM的

8、Glu，撤去EGF、bFGF和FBS，另添加10mM尼克酰胺，71.5uM β-疏基乙醇)對培養(yǎng)細(xì)胞誘導(dǎo)分化。以掃描與透射電鏡觀察細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)形態(tài)；免疫熒光法檢測胰島素、胰高血糖素、PDX-1、CK-19以及Ngn3等抗原的表達(dá)；雙硫腙染色檢測干細(xì)胞分化前后β細(xì)胞比率；放免法測定細(xì)胞胰島素分泌水平；PCR技術(shù)檢測PDX-1 mRNA、CK-19mRNA、Ngn-3 mRNA和胰島素mRNA的表達(dá)情況。 (2)取Wistar大鼠

9、50只，經(jīng)尾靜脈一次性注射鏈脲佐菌素(60 mg/kg bodyweight)，隨機(jī)血糖＞16.7mM并持續(xù)穩(wěn)定1周為造模成功。然后將成模大鼠隨機(jī)分為5組：A組(n=5，對照組，經(jīng)門靜脈注射生理鹽水)、B組(n=10，經(jīng)門靜脈移植未分化PSCs)、C組(n=10，經(jīng)門靜脈移植已分化細(xì)胞)、D組(n=10，腎包膜下移植未分化PSCs)和E組(腎包膜下移植已分化細(xì)胞)。移植術(shù)后監(jiān)測大鼠的隨機(jī)血糖、體重和胰島素的變化；移植后13天和28天行經(jīng)

10、腹腔注射的葡萄糖耐量試驗；術(shù)后14天和30天分兩批處死全部大鼠，取A、B、C三組大鼠的肝臟和D、E兩組大鼠的腎臟做病理切片和免疫組織熒光染色，測量體內(nèi)“類胰島結(jié)構(gòu)”的直徑、觀察其形態(tài)以及胰島素表達(dá)的情況. 結(jié)論： (1)本研究利用膠原酶消化法得到的細(xì)胞具有高度增值能力和分化成胰島細(xì)胞的潛能，經(jīng)多種實驗技術(shù)方法證實是來源于導(dǎo)管上皮的胰腺干細(xì)胞。低糖培養(yǎng)基的條件下，有助于胰腺干細(xì)胞的分化成熟。 (2)經(jīng)過體外條件誘導(dǎo)