同種異體胰島及胰腺干細(xì)胞來源的胰島樣結(jié)構(gòu)序貫移植治療糖尿病.pdf

1、目的：
　　通過分離、純化大鼠的胰島及胰腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞，并在體外一定條件下培養(yǎng)，使胰腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞擴(kuò)增、轉(zhuǎn)分化為具有胰島素分泌功能的胰島細(xì)胞，將胰島及誘導(dǎo)分化2周的胰腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞來源的胰島樣結(jié)構(gòu)序貫移植到藥物誘導(dǎo)的糖尿病大鼠體內(nèi)，觀察糖尿病大鼠的血糖及生存情況來探討胰島及胰腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞來源的胰島樣結(jié)構(gòu)序貫移植治療糖尿病的可能性并為將此方法用于臨床提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法：
　　將大鼠胰腺組織以膠原酶V消化，然后用非

2、連續(xù)性密度梯度離心法將胰腺外分泌細(xì)胞、導(dǎo)管上皮細(xì)胞和胰島分離純化，導(dǎo)管上皮細(xì)胞即具有轉(zhuǎn)分化潛能的胰腺干細(xì)胞，在體外經(jīng)CMRL1066及不含血清的DMEM／F12加多種營養(yǎng)因子的培養(yǎng)液中培養(yǎng)27d。于培養(yǎng)的不同時(shí)間點(diǎn)（1，3，5，7，14，21，27d）取細(xì)胞作PDX-1、CK-19等單抗的免疫組化染色,光鏡和電鏡觀察不同時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化。按照60mg／kg腹腔注射鏈脲佐菌素(STZ)，選取連續(xù)2次血糖濃度高于16．7mmol／L的

3、大鼠作為糖尿病模型。采用完全隨機(jī)法將已成模的糖尿病大鼠分為3組：A組：胰島移植組13只，腎被膜下植入新鮮大鼠胰島（200±50個(gè)）；B組：胰島及胰腺干細(xì)胞來源的胰島樣結(jié)構(gòu)序貫移植組13只，腎被膜下植入新鮮大鼠胰島（200±50個(gè)）及胰腺干細(xì)胞來源的胰島樣結(jié)構(gòu)約2×106個(gè)；C組：糖尿病對(duì)照組10只，腎被膜下植入培養(yǎng)液。3組大鼠均于移植前及移植后48h測空腹血糖濃度，之后每天經(jīng)尾靜脈采血測空腹血糖觀察生存情況。
　　結(jié)果：
　

4、　通過分離純化平均每只大鼠可獲得100±50個(gè)胰島及大量胰腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞。體外培養(yǎng)時(shí)光鏡下胰腺干細(xì)胞在培養(yǎng)后第1d即貼壁生長。培養(yǎng)5d內(nèi)，貼壁細(xì)胞迅速擴(kuò)增為鵝卵石樣小細(xì)胞片、大細(xì)胞片進(jìn)而分裂增殖成單層細(xì)胞。細(xì)胞培養(yǎng)第7d，鵝卵石樣細(xì)胞片迅速擴(kuò)大，胰島樣芽團(tuán)開始從細(xì)胞片或單層細(xì)胞的中央或邊緣出現(xiàn)。培養(yǎng)第21到27d，大量較成熟的胰島樣結(jié)構(gòu)出現(xiàn)，雙硫腙染色呈強(qiáng)陽性。細(xì)胞培養(yǎng)第7d，幾乎所有細(xì)胞表面均可見短粗的微絨毛及細(xì)胞間較致密的連接復(fù)合體

5、。第15d，部分細(xì)胞的短粗微絨毛消失，細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)大小不等且密度不均的顆粒，其周圍可見較多的中間絲。第27d，部分細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)密度較高的顆粒，另有部分細(xì)胞內(nèi)有較多具有低密度暈環(huán)的顆粒，大量含顆粒的細(xì)胞連接成片，中間絲基本消失。免疫組織化學(xué)染色顯示：細(xì)胞培養(yǎng)第1d，6孔玻板中的部分細(xì)胞呈CK-l9抗體染色強(qiáng)陽性。大部分細(xì)胞呈PDX-l抗體染色陽性，部分呈強(qiáng)陽性，部分呈弱陽性，少數(shù)細(xì)胞為陰性。第7d起，可見胰島樣細(xì)胞芽團(tuán)出現(xiàn)并逐漸增多，絕大多數(shù)

6、細(xì)胞集落和胰島樣細(xì)胞芽團(tuán)均為CK-19強(qiáng)陽性。14d至27d，胰島樣細(xì)胞芽團(tuán)不斷增大，PDX-l抗體染色呈強(qiáng)陽性。移植前3組大鼠的血糖均在16.7mmol／L以上，胰島移植組和胰島+胰腺干細(xì)胞來源的胰島樣結(jié)構(gòu)序貫移植組在移植后1周內(nèi)測血糖濃度均有所降低，序貫移植組降低的幅度較胰島組大，但仍高于10mmol／L。第2周后兩組的血糖濃度均降低到10mmol／L以下，序貫移植組大鼠的血糖均低于胰島移植組。第3周后胰島移植組的血糖開始上升逐漸升

7、高到移植前的血糖水平，而序貫移植組的血糖則維持到5mmol／L水平。糖尿病對(duì)照組大鼠血糖濃度始終在16.7mmol／L以上，無一血糖下降。
　　結(jié)論：
　　通過分離、純化可以獲得大量的新鮮胰島和胰腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞，大鼠的胰腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞具有干細(xì)胞潛能，在合適的培養(yǎng)條件下早期即能夠轉(zhuǎn)分化為PDX-1陽性的胰腺干細(xì)胞。胰腺干細(xì)胞體外可誘導(dǎo)分化為分泌胰島素的胰島樣結(jié)構(gòu)，胰島及胰腺干細(xì)胞來源的胰島樣結(jié)構(gòu)序貫移植可有效地糾正糖代謝紊亂對(duì)