人臍血內皮祖細胞移植治療下肢缺血的實驗研究.pdf

1、【目的】
　　 本研究旨在從人臍帶血中培養(yǎng)和擴增內皮祖細胞，同時對內皮祖細胞活性進行刺激，觀察移植擴增處理后的內皮祖細胞對缺血下肢的影響，為臍血內皮祖細胞移植治療下肢缺血性疾病提供實驗依據。
　　 【方法】
　　 1、取健康孕婦分娩后臍血，以密度梯度離心法分離臍血單個核細胞，接種于包被有人纖維連接蛋白的培養(yǎng)板中，2天后收集懸浮細胞重新貼壁培養(yǎng)到第7天，觀察細胞生長情況，并對貼壁細胞通過免疫組化、免疫熒光和流式細胞

2、技術進行鑒定，證明其為內皮祖細胞。
　　 2、7天后消化收集內皮祖細胞，將細胞制成細胞懸液，加入24孔培養(yǎng)板，分別按照不同基礎培養(yǎng)基種類（M199、EGM-2、DMEM）,不同細胞接種密度（1×103、1×104、1×105/cm2），不同胎牛血清濃度（5％、10％、20％）和不同細胞因子組合（VEGF、VEGF+bFGF、VEGF+bFGF+EPO）等條件進行培養(yǎng)，實驗按L9（34）正交設計分組。7天后計算細胞個數，統(tǒng)計細胞擴

3、增倍數，篩選出令細胞擴增倍數最多的培養(yǎng)條件，并對擴增后的內皮祖細胞進行表面標志、免疫熒光和血管形成功能鑒定。分別用10ng/ml、50ng/ml、100ng/ml的SDF-1處理擴增后的內皮祖細胞，并設對照組，應用改良的Boyden小室測定細胞的遷移能力，并測定細胞的黏附能力。
　　 3、建立缺血后肢動物模型，隨機分4組,分別為局部移植EPCs（A組），擴增后的EPCs+SDF-1（B組）、SDF-1（C組）和細胞培養(yǎng)液（D組）

4、，移植后進行肢體缺血評估，觀察缺血裸鼠后肢皮膚色澤，檢測皮溫差，統(tǒng)計后肢保肢率，觀察缺血肌肉血管新生情況，分析擴增處理內皮祖細胞對移植效率的影響。
　　 【結果】
　　 1、臍血單個核細胞培養(yǎng)第5天可見貼壁細胞呈集落樣生長，10天后大多數細胞呈梭形，第21天可見鋪路石樣結構。第7天的貼壁細胞吞噬DiI-acLDL后，在倒置顯微鏡下觀察呈紅色熒光；結合FITC-UEA-1后呈綠色熒光；雙染色陽性細胞為黃色熒光，倒置顯微鏡下

5、計數雙染色陽性細胞>75％。流式細胞儀檢測CD34陽性表達率為51.4％，CD133陽性表達率為28.7％，VEGFR-2陽性表達率為82.8％，F(xiàn)VIII因子陽性率>80％。
　　 2、內皮祖細胞經各種條件培養(yǎng)后數量均有增加，各因素對擴增細胞的作用為細胞因子>基礎培養(yǎng)基>胎牛濃度>接種密度，在接種密度為1×104/cm2，含5％的FBS及添加了細胞因子（VEGF+bFGF+EPO）的M199培養(yǎng)液里內皮祖細胞擴增倍數最多，可達

6、80余倍。擴增后的內皮祖細胞CD34、CD133、VEGFR-2陽性表達率為分別為41.6％、23.6％和88.3％，免疫熒光雙染色陽性細胞>65％，Ⅷ因子陽性表達率>85％。內皮祖細胞在體外ECMatrixTM上孵育可以形成網狀血管樣結構。內皮祖細胞遷移實驗和粘附實驗顯示，對照組、SDF-1濃度分別為l0ng/ml,50ng/ml,100ng/ml時，細胞遷移數分別為19.33±2.02個，29.33±1.45個，71.66±3.48

7、個和88.66±2.60個，細胞的粘附個數分別為29.3±1.52個，44.6±2.51個，74.6±2.51個和84.0±3.00個。SDF-1各濃度的細胞遷移數和粘附數與對照組比較均有顯著性差異(P＜0.05)，10ng/ml組與50ng/ml組、50ng/ml組與100ng/ml組相比較，P＜0.05。
　　 3、28天后，經過處理的裸鼠后肢缺血評分平均為A組1.9分、B組1.4分、C組2.4分和D組2.5分；后肢保肢率為

8、A組40％、B組保肢率為60％、C組保肢率為20％、D組保肢率為20％；術后14 d、28 d，缺血裸鼠后肢皮溫差A組、B組較D組明顯減少（P＜0.05），B組較A組明顯減少（P＜0.05），均具有統(tǒng)計學意義；術后28 d，四組肌肉毛細血管密度分別為3.94±1.26、5.63±1.22、2.52±0.87、2.37±0.66，A組、B組毛細血管密度顯著大于D組（P＜0.05），B組大于A組（P＜0.05），均有統(tǒng)計學意義，而C組與D組

9、無明顯統(tǒng)計學意義。
　　 【結論】
　　 1、通過體外擴增的方法能從臍帶血中獲取足夠數量的內皮祖細胞，內皮祖細胞在接種密度為1×104/cm2，含5％的胎牛血清及添加了細胞因子VEGF+bFGF+EPO的M199培養(yǎng)液里擴增倍數最多；
　　 2、SDF-1增加內皮祖細胞的遷移和粘附能力并具有劑量依賴性，在體內促進內皮祖細胞歸巢；
　　 3、內皮祖細胞能通過增加裸鼠缺血后肢的血管密度來改善下肢缺血的癥狀；<