人臍血內(nèi)皮祖細(xì)胞移植于心肌梗死裸鼠的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、傳統(tǒng)觀念認(rèn)為心肌細(xì)胞是一種終末分化細(xì)胞,當(dāng)心肌細(xì)胞發(fā)生缺血時,早期心肌細(xì)胞大量壞死,心臟收縮功能減退；后期壞死心肌被纖維結(jié)締組織所替代,非缺血區(qū)域心肌離心性肥厚進(jìn)一步導(dǎo)致心肌功能降低。冠狀動脈血供的重建是治療心肌梗死最有效和最根本的方式,而近年來新興的細(xì)胞移植技術(shù),開拓了治療心肌梗死一種新的途徑。本文探討細(xì)胞介導(dǎo)的血管生成正是通過移植細(xì)胞促進(jìn)缺血區(qū)血運(yùn)重建來改善心功能及心肌梗死預(yù)后。我們研究目的是證實(shí)臍血中單個核細(xì)胞(mononucle

2、ar cells,MNCs)通過適當(dāng)培養(yǎng)條件可以分化形成具有內(nèi)皮細(xì)胞特征的細(xì)胞即內(nèi)皮祖細(xì)胞(endothelial progenitor cells,EPCs),移植進(jìn)入具有心肌梗死的裸鼠體內(nèi)中,利用裸鼠的免疫缺陷,觀察人臍血EPCs對梗死區(qū)域新生血管的影響,探討人臍靜脈血EPCs移植治療裸鼠心肌梗死的有效性。
　　 第一部分 人臍血單個核細(xì)胞的誘導(dǎo)培養(yǎng)及內(nèi)皮祖細(xì)胞特性的觀察
　　 目的:
　　 研究從新鮮人臍靜

3、脈血中提取并分離單個核細(xì)胞,在體外培養(yǎng)并加入誘導(dǎo)劑進(jìn)行誘導(dǎo)分化,并對此類細(xì)胞進(jìn)行鑒定證實(shí)此類細(xì)胞為內(nèi)皮祖細(xì)胞。
　　 方法:
　　 1.人臍靜脈血的采取:經(jīng)產(chǎn)婦及其家屬同意,隨機(jī)選取5例足月行剖腹產(chǎn)的健康產(chǎn)婦作為臍血采取對象。預(yù)先將肝素與生理鹽水配制成濃度為50u/ml,待胎盤剝離后無菌條件下立即用4ml肝素抗凝的注射器采集臍靜脈血。采血量40ml,充分搖勻后待分離,2小時內(nèi)處理。
　　 2.臍血單個核細(xì)胞分離:

4、臍血與DMEM培養(yǎng)基1:1稀釋。取稀釋后臍血小心平鋪于等體積的Bioshop淋巴細(xì)胞分離液上,于2000 r/min下離心20min。離心后管內(nèi)分為三層,上層為血漿,下層主要為紅細(xì)胞和粒細(xì)胞。中層為淋巴細(xì)胞分離液,在上、中層界面處有一層以單個核細(xì)胞為主的白色云霧層狹窄帶。吸取單個核細(xì)胞,加入5倍以上體積的無血清DMEM,于1500r/m下離心10分鐘,洗滌細(xì)胞一次。
　　 3.誘導(dǎo)條件:應(yīng)用DMEM培養(yǎng)基和20％胎牛血清,其內(nèi)添

5、加血管內(nèi)皮生長因子(VEGF165,20 ng/ml),堿性成纖維細(xì)胞生長因子(b-FGF,1 ng/ml),胰島素樣生長因子-1(IGF-1,2 ng/ml),谷氨酰胺(300μg/ml),青霉素G(100U/ml)和鏈霉素(100mg/L)。接種于明膠包被的6孔培養(yǎng)板,接種密度5×105/ml。第3日開始第一次換液,以后每2～3日換液一次,換液前于倒置顯微鏡下觀察并記錄細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變。
　　 4.檢測指標(biāo):貼壁細(xì)胞在培養(yǎng)7日

6、時,細(xì)胞在含DiI-acLDL(10μg/mL)的培養(yǎng)液中37℃避光孵育4 h,然后以4％的中性甲醛固定10min,PBS液漂洗后加FITC-UEA-1(10μg/mL)避光孵育1h。PBS液漂洗后在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞熒光染色,FITC-UEA-1和Dil-acLDL兩種染色陽性細(xì)胞為正在分化的EPCs。用流式細(xì)胞儀檢測培養(yǎng)7 R后貼壁細(xì)胞CD34+及CD133+的陽性率。用RT-PCR研究培養(yǎng)細(xì)胞內(nèi)是否存在VEGFR-2 mRNA。

7、
　　 結(jié)果:
　　 1.EPC細(xì)胞形態(tài)改變:密度梯度離心法分離的MNCs經(jīng)臺盼藍(lán)染色汁算活細(xì)胞百分率達(dá)95％以上。MNCs經(jīng)過上述條件培養(yǎng)后,在顯微鏡下觀察細(xì)胞的生長特性。MNCs呈圓形,均勻地懸浮分布。3日后棄去非貼壁細(xì)胞,可見少量梭形細(xì)胞出現(xiàn)。培養(yǎng)早期可見圓形細(xì)胞類似于白細(xì)胞,但培養(yǎng)7日后圓形細(xì)胞明顯減少并出現(xiàn)小集落。培養(yǎng)貼壁細(xì)胞1周后可見細(xì)胞呈現(xiàn)梭形或1-3個多突起細(xì)胞。高倍鏡下這些細(xì)胞細(xì)胞核較大,部分細(xì)胞可見分

8、裂相。2周左右小集落逐漸形成典型集落。3周左右集落間相互融合,梭形細(xì)胞逐漸縮短,并出現(xiàn)內(nèi)皮細(xì)胞的典型“鋪路石”樣改變。
　　 2.流式細(xì)胞儀檢測:取第7日貼壁細(xì)胞進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測,CD34和CD133陽性率分別為(50.48±5.17)％和(19.12±4.37)％。
　　 3.熒光顯微鏡檢測:超過90％的貼壁細(xì)胞能夠攝取DiI-acLDL和FITC-UEA-1。
　　 4.RT-PCR檢測:RT-PCR提示分

9、離培養(yǎng)的貼壁細(xì)胞有VEGF receptor-2擴(kuò)增產(chǎn)物。
　　 結(jié)論:
　　 我們應(yīng)用梯度離心法分離臍血單個核細(xì)胞,接種于明膠包被的塑料培養(yǎng)板,在有VEGF,bFGF和IGF-1存在的條件下培養(yǎng)。雖然在接種早期這些細(xì)胞仍混有造血細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等,但進(jìn)一步培養(yǎng)誘導(dǎo)可以獲得較純的EPCs細(xì)胞。EPCs有許多表面分子,本實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用國際常用的EPCs鑒定指標(biāo),對從臍血中誘導(dǎo)分化的細(xì)胞進(jìn)行鑒定。其中流式細(xì)胞儀鑒定顯示誘導(dǎo)7日后細(xì)

10、胞CD34陽性率達(dá)(50.48±5.17)％,CD133陽性率達(dá)(19.12±4.37)％,90％以上的貼壁細(xì)胞兩種熒光染色陽性,并且能表達(dá)VEGFR-2。以上均提示,該方法能簡捷快速誘導(dǎo)臍血中的MNCs分化為EPCs。
　　 第二部分 人臍靜脈血內(nèi)皮祖細(xì)胞移植于心肌梗死裸鼠的實(shí)驗(yàn)研究
　　 目的:
　　 人臍靜脈血的EPCs具有免疫功能尚不成熟,其免疫原性弱,移植物抗宿主病發(fā)生率低,以及移植后對HLA位點(diǎn)不合耐

11、受性高等特點(diǎn)。將人臍靜脈血單個核細(xì)胞在體外培養(yǎng)7日后的貼壁細(xì)胞作為內(nèi)皮祖細(xì)胞進(jìn)行移植于建立裸鼠的心肌梗死模型中,利用裸鼠的免疫缺陷,觀察人臍血內(nèi)皮祖細(xì)胞對裸鼠心肌梗死面積以及梗死區(qū)域新生血管影響,探討該細(xì)胞移植治療缺血性心臟病的有效性和可能性。
　　 方法:
　　 1.分組:雌性BALB/c-nu裸鼠20只,隨機(jī)分成實(shí)驗(yàn)組和對照組(n=10)。
　　 2.動物模型的建立:腹腔注射10％水合氯醛溶液麻醉,每只0.0

12、5ml,效果欠佳者追加0.02ml。連接16通道生理記錄儀(PowerLab,澳大利亞ADInstruments公司),記錄心電圖。胸骨上正中線處切開皮膚長約0.5cm,游離氣管并切開后用24G靜脈留置針插管,小動物呼吸機(jī)(DH-150,浙江大學(xué)產(chǎn))維持,定容模式,呼吸頻率90次/min,潮氣量為3～6ml,吸氣:呼氣比為1:1,出現(xiàn)胸廓抬舉及透過皮膚可見雙肺擴(kuò)張良好表明氣管插管成功。胸部正中縱行切開約1cm打開胸腔,用止血鉗牽拉胸壁以

13、暴露心臟。用無齒鑷輕輕固定心臟,在動脈圓椎與左心耳之間以7-0 Prolene線結(jié)扎左冠狀動脈,然后觀察左室顏色改變,并記錄心電圖改變。結(jié)扎后出現(xiàn)左室變白,心電圖出現(xiàn)ST段抬高即為結(jié)扎成功,關(guān)閉胸腔時將潮氣量稍微調(diào)大。
　　 3.處理方法:將培養(yǎng)7日后的貼壁細(xì)胞于含CM-Dil(2μg/mL)的培養(yǎng)液中37℃避光孵育5min,然后置于4℃冰箱內(nèi)孵育15min后搜集細(xì)胞并離心濃度為107/ml待用。實(shí)驗(yàn)組于尾靜脈注射0.3ml濃度

14、為107/ml預(yù)先離心好并標(biāo)記CM-Dil的EPCs,對照組直接注射DMEM培養(yǎng)基。
　　 4.實(shí)驗(yàn)結(jié)果的觀察:術(shù)后2周后處死裸鼠,心臟于液氮凍存30min后取長軸垂直方向1～2mm厚切片,以TTC染色法計算心肌梗死面積。其余標(biāo)本行冰凍切片(厚度5μm),于熒光顯微鏡下觀察冰凍切片心肌梗死部位新生毛細(xì)血管的熒光。光學(xué)顯微鏡下觀察實(shí)驗(yàn)組及對照組心肌梗死部位的組織學(xué)改變。每張切片在高倍視野(×200)下在梗死交界區(qū)隨機(jī)取5個視野,計

15、算每張切片的平均毛細(xì)血管數(shù)。
　　 結(jié)果:
　　 術(shù)后2周實(shí)驗(yàn)組存活7只,對照組存活6只,全組實(shí)驗(yàn)中心肌梗死模型存活率為65％。
　　 1.心肌梗死面積:術(shù)后2周處死裸鼠后,心肌梗死區(qū)域病理切片可見毛細(xì)血管和成纖維細(xì)胞的生長；計算心肌梗死面積,實(shí)驗(yàn)組平均梗死面積為(8.27±1.64)％,對照組為(14.30±2.84)％,兩組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=-4.78,P=0.001)。
　　 2.毛細(xì)血管密度:

16、術(shù)后2周計數(shù)毛細(xì)血管密度,實(shí)驗(yàn)組每高倍視野平均新生血管密度為14.29±1.38,對照組為10.17±1.72,兩組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=4.79,P=0.001)。
　　 3.梗死區(qū)新生血管熒光:術(shù)后2周處死裸鼠后,熒光顯微鏡下觀察可見實(shí)驗(yàn)組新生血管處有呈管狀分布的紅色熒光,而對照組為陰性。
　　 結(jié)論:
　　 裸鼠體積較小,無論直接或者間接測定其心臟功能均較困難,本實(shí)驗(yàn)采用EPCs移植后心肌梗死面積的改變及毛

17、細(xì)血管密度的變化,判斷移植在缺血性心臟病治療中的可能性及有效性。本組實(shí)驗(yàn)中實(shí)驗(yàn)組平均梗死面積小于對照組,而毛細(xì)血管密度高于對照組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義。另外,CM-Dil常用來作為熒光示蹤劑,本實(shí)驗(yàn)中將攝取有CM-Dil的EPCs細(xì)胞移植到裸鼠體內(nèi),兩周后在熒光顯微鏡下觀察新生血管可見紅色熒光,證實(shí)新生毛細(xì)血管中有EPCs參與。EPCs移植對于心臟功能有益影響的確切機(jī)制尚待進(jìn)一步的證實(shí),可能是通過特異性生成新生血管組織,分化成為成熟內(nèi)皮細(xì)胞