川芎嗪聯(lián)合超聲微泡介導(dǎo)內(nèi)皮祖細(xì)胞移植治療大鼠心肌梗死的研究.pdf

1、第一部分內(nèi)皮祖細(xì)胞的分離、培養(yǎng)、鑒定
　　目的：體外分離、培養(yǎng)、鑒定大鼠骨髓來源的內(nèi)皮祖細(xì)胞(Endothelial Progenitor Cells，EPCs)，并誘導(dǎo)分化成為成熟血管內(nèi)皮細(xì)胞。
　　方法：無菌分離大鼠四肢長骨，取骨髓沖洗液，Percoll密度梯度離心法分離單個(gè)核細(xì)胞，接種于人纖維連結(jié)蛋白(human fibronection，HFN)鋪被的培養(yǎng)瓶，用加入人表皮生長因子(epidermal growth f

2、actor，EGF)、大鼠血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、人堿性成纖維細(xì)胞生長因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，對(duì)其進(jìn)行細(xì)胞形態(tài)學(xué)，免疫細(xì)胞化學(xué)，流式細(xì)胞術(shù)，透射電鏡，以及Dil-acLDL、FITC-UEA-1雙熒光染色的檢測。
　　結(jié)果：可以從骨髓中分離出大量EPCs，且細(xì)胞增殖能力強(qiáng)，連續(xù)傳代四次

3、，細(xì)胞活性不降低。鏡下觀察隨時(shí)間變化，細(xì)胞依次呈現(xiàn)圓形，橢圓形，梭形，條索形等形態(tài)，細(xì)胞集落生長并可呈網(wǎng)狀、旋渦狀生長后期呈典型的鋪路石樣形態(tài)。通過細(xì)胞免疫組織化學(xué)染色和流式細(xì)胞術(shù)發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞表面標(biāo)志物在不同時(shí)期表達(dá)率不同，其中CD133早期表達(dá)率高，隨培養(yǎng)時(shí)間延長，表達(dá)率降低。透射電鏡檢查，后期細(xì)胞胞漿中發(fā)現(xiàn)W-P小體。激光共聚焦顯微鏡觀察，Dil-acLDL、FITC-UEA-1雙染。
　　結(jié)論：密度梯度離心法，可以獲得大量單個(gè)

4、核細(xì)胞，經(jīng)選擇性完全培養(yǎng)基培養(yǎng)可獲純度較高的。EPCs，并可在體外誘導(dǎo)分化成血管內(nèi)皮細(xì)胞。
　　第二部分川芎嗪聯(lián)合超聲微泡介導(dǎo)內(nèi)皮祖細(xì)胞治療大鼠心肌梗死
　　目的：探討在川芎嗪聯(lián)合超聲微泡的輔助下，內(nèi)皮祖細(xì)胞移植可否更好歸巢大鼠缺血心肌，達(dá)到治療心肌梗死的效果。
　　方法：大鼠心肌梗死模型制備：永久結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左前降支。隨機(jī)分為5個(gè)組：
　　(1)川芎嗪+EPCs+超聲微泡組。
　　(2)川芎嗪+EPCs組

5、。
　　(3)EPCs組。
　　(4)空白對(duì)照組。
　　(5)單純心肌梗死組。
　　建模后第三天，經(jīng)經(jīng)尾靜脈輸入川芎嗪+EPCs+超聲微泡混合液，同時(shí)超聲轉(zhuǎn)染治療儀輻照大鼠心前區(qū)。細(xì)胞移植35d)舌M型超聲心動(dòng)圖檢測LVEF及FS以評(píng)價(jià)心功能，免疫組織化學(xué)法行5-溴脫氧尿嘧啶核酸(5-bromodeoxyuridine，5-Brdu)及血管內(nèi)皮細(xì)胞粘附因子(Vascular cell adhere moldcul