超聲微泡介導(dǎo)HGF治療大鼠心肌梗死的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、冠心病(CHD)是嚴(yán)重威脅人類(lèi)生命和健康的常見(jiàn)疾病。雖然經(jīng)皮冠脈成形術(shù)(PTCA)和冠狀動(dòng)脈旁路移植術(shù)(CABG)挽救了很多患者的生命，但部分嚴(yán)重患者的病情并未因此得到明顯改善。近年來(lái)基因治療迅速發(fā)展，為冠心病患者提供了一個(gè)新的治療策略，但目前由于尚缺乏一種安全、穩(wěn)定、高效的基因轉(zhuǎn)染方法，而極大地限制了基因治療在臨床上的廣泛應(yīng)用。新近研究發(fā)現(xiàn)，超聲靶向破壞微泡定位釋放技術(shù)(Ultrasound-targeted microbubble

2、destruction，UTMD)是一種新型的無(wú)創(chuàng)性基因轉(zhuǎn)移技術(shù)。開(kāi)展對(duì)UTMD介導(dǎo)目的基因靶向治療的深入研究可望為冠心病的基因治療帶來(lái)新的治療措施。 本課題是通過(guò)構(gòu)建攜有增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(EGFP)和肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)基因的真核共表達(dá)載體(pIRES2-EGFP/HGF)，制備一種能與pIRES-EGFP/HGF 基因高效結(jié)合的超聲微泡造影劑，然后運(yùn)用超聲靶向破壞微泡(UTMD)介導(dǎo)HGF治療大鼠心肌梗死，觀察治療后E

3、GFP及HGF基因在缺血心肌內(nèi)的表達(dá)情況及治療效果，為研究和評(píng)價(jià)超聲靶向破壞微泡介導(dǎo)的心臟基因轉(zhuǎn)染提供可靠的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，為冠心病基因治療提供一個(gè)新的途徑和手段。本課題研究主要包括以下三個(gè)部分的內(nèi)容： 第一部分增強(qiáng)型綠色熒光蛋白與肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子共表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定 目的:構(gòu)建增強(qiáng)型綠色熒光蛋白與人肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子的基因真核共表達(dá)載體并鑒定其在真核細(xì)胞中的表達(dá)。 方法:在 HGF 兩端設(shè)計(jì)并合成分別帶有Sac Ⅰ和Ba

4、mH Ⅰ兩酶切位點(diǎn)的一對(duì)引物，對(duì)pcDNA3.0-HGF載體進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將擴(kuò)增出的目的基因與pMD18-T載體相連接，并轉(zhuǎn)化至大腸肝菌，進(jìn)行菌落PCR、酶切分析和DNA測(cè)序鑒定重組克隆。用Sac Ⅰ和BamHⅠ將目的基因片段用雙酶切切下后，純化提取凝膠中的目的DNA片斷，然后插入plRES2-EGFP相應(yīng)的酶切位點(diǎn)，構(gòu)建pIRES2-EGFP/HGF真核表達(dá)載體并再進(jìn)行雙酶切鑒定。將重組質(zhì)粒用脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染至人血管內(nèi)皮細(xì)胞(HUEVC

5、)中，熒光顯微鏡下觀察EGFP在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)，Western blot檢測(cè)HGF蛋白的表達(dá)情況。 結(jié)果:重組克隆載體內(nèi)的目的基因片段序列與GENEBANK上報(bào)道的HGF基因序列完全一致，pIRES-EGFP/HGF酶切鑒定結(jié)果與預(yù)期結(jié)果一致。熒光顯微鏡下觀察可見(jiàn)轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞發(fā)出綠色熒光；Westernblot結(jié)果表明HGF基因得到了有效表達(dá)。 結(jié)論:本實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建EGFP和HGF真核共表達(dá)載體并可在真核細(xì)胞中有效表達(dá)。

6、 第二部分載基因脂質(zhì)超聲造影劑的制備及其特性的實(shí)驗(yàn)研究 目的:制備一種可作為基因載體的脂質(zhì)超聲造影劑，對(duì)其理化性質(zhì)、兔腎顯影效果及載基因能力進(jìn)行研究。 方法:采用機(jī)械振蕩法制備一種可作為基因載體脂質(zhì)超聲微泡造影劑，觀察<'60>Co<,γ>射線(xiàn)滅菌前后造影劑外觀、形態(tài)、濃度、平均粒徑和電位改變，并觀察其對(duì)正常兔腎顯影效果，檢測(cè)其結(jié)合基因的能力。 結(jié)果:自制脂質(zhì)微泡的平均粒徑范圍為2.11～6.43μm，平均

7、粒徑2.79μm，粒徑分布均勻，濃度約為(3.16±0.29)×10<'9>個(gè)/ml；經(jīng)<'60>Co<,γ>射線(xiàn)滅菌后在顯微鏡下觀察微泡形態(tài)，粒徑大小及電位等均無(wú)明顯變化；體內(nèi)造影顯示該造影劑能夠有效增強(qiáng)兔腎實(shí)質(zhì)回聲；基因結(jié)合量效優(yōu)化結(jié)果顯示，造影劑的最大基因結(jié)合效率為22％，最大基因結(jié)合量為0.45 mg/ml。 結(jié)論:自制脂質(zhì)超聲造影劑符合理想超聲造影劑的要求，性質(zhì)穩(wěn)定，制備簡(jiǎn)易，載基因效率高，可望成為一種新型的超聲微泡造

8、影劑以及基因或藥物治療的載體。 第三部分超聲靶向破壞微泡介導(dǎo)HGF促進(jìn)大鼠梗死心肌血管新生的實(shí)驗(yàn) 目的:探討超聲靶向破壞微泡介導(dǎo)HGF促進(jìn)大鼠梗死心肌血管新生的可行性，并評(píng)價(jià)其治療效果。 方法:將40只 Wistar 大鼠制備成心肌梗死模型后隨機(jī)分為4組，即①HGF+超聲+微泡組(HGF+ultrasound+ microbubble，HGF+US/MB)，②HGF+超聲組(HGF+ultrasound grou

9、p， HGF+US)，③HGF+微泡組(HGF+microbubble group，HGF+MB)，④單純手術(shù)組(surgery alone group，SA)。①組采用超聲心電觸發(fā)靶向破壞心肌內(nèi)攜基因微泡，②組采用基因聯(lián)合超聲心電觸發(fā)，而不用微泡，③組只由靜脈輸入載基因微泡，④組由靜脈注入等量生理鹽水作為對(duì)照。于基因轉(zhuǎn)染后14 d處死各組大鼠，熒光顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白在各組大鼠心肌、肝及腎組織內(nèi)的表達(dá)情況，免疫組織化學(xué)法(IHC)

10、檢測(cè)缺血心肌周?chē)?CD34 的表達(dá)，并在顯微鏡下計(jì)數(shù)心肌內(nèi)新生微血管密度(MVD)，Western blot和 ELISA 法檢測(cè)心肌組織內(nèi)HGF蛋白表達(dá)情況，并對(duì)心肌內(nèi)HGF含量與MVD進(jìn)行相關(guān)性分析。 結(jié)果:熒光顯微鏡下可見(jiàn)在HGF+US/MB組大鼠心肌中有大量的綠色熒光蛋白的表達(dá)，且心室前壁的表達(dá)高于后壁，在HGF+US組中僅于小血管及毛細(xì)血管的內(nèi)皮細(xì)胞中有少量綠色熒光蛋白的表達(dá)，而SA組及HGF+MB組的心肌內(nèi)無(wú)綠色熒光

11、蛋白的表達(dá)；各組大鼠肝及腎組織內(nèi)均未觀察到EGFP的表達(dá)。IHC 結(jié)果顯示，CD34定位于血管內(nèi)皮細(xì)胞胞膜和胞漿，顯示為棕黃色或棕褐色顆粒，新生的微血管被染成棕黃色，顯微鏡下計(jì)數(shù)每高倍鏡視野下的MVD，結(jié)果表明在HGF+US/MB組心肌中MVD 最高，為266.9±39.83(個(gè)/高倍鏡視野)，與其它各組相比較均有顯著性差異(P<0.01)。Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示：HGF+US/MB組中可見(jiàn)一69 kD大小蛋白條帶表達(dá)，H

12、GF+US組可見(jiàn)同等大小的弱蛋白條帶表達(dá)，而在HGF+MB組及 SA 組中無(wú)明顯蛋白條帶。ELISA 結(jié)果顯示HGF在HGF+US/MB組心肌中表達(dá)最高，為5.54±0.81 ng/g，目前壁表達(dá)高于后壁(P<0.05)，與其它各組心肌 HGF 含量相比較均有顯著性差異(P<0.01)。相關(guān)分析表明，心肌中 HGF 的含量與MVD呈明顯正相關(guān)。 結(jié)論:超聲靶向破壞微泡可介導(dǎo)HGF基因在缺血心肌內(nèi)的高效轉(zhuǎn)移并促進(jìn)血管新生，為心肌梗