藥物提高心肌干細胞治療急性心肌梗死療效的實驗研究.pdf

1、本文主要從以下幾個部分展開論述:
　　摘要（一） 阿托伐他汀預(yù)處理提高心肌干細胞移植治療急性心肌梗死療效的實驗研究
　　目的:心肌干細胞(cardiac stem cells，CSCs)移植治療急性心肌梗死(acute myocardialinfarction，AMI)的療效受到存活率低和歸巢細胞數(shù)量少的限制?；|(zhì)細胞衍生因子1(stromal cell-derived factor-1，SDF-1)與其特異性受體趨化因子受

2、體4(CXCchemokine receptor4，CXCR4)構(gòu)成的SDF-1/CXCR4軸在CSCs遷移的過程中發(fā)揮重要作用;而PODXL(podocalyxin-like protein1，podocalyxin)是CSCs細胞膜上的一個表面標記，被證實在細胞粘附和細胞間相互作用中發(fā)揮重要作用。本研究在體外缺氧無血清條件下模擬心肌缺氧微環(huán)境，研究阿托伐他汀(atorvastatin，ATV)對小鼠CSCs的抗凋亡作用及可能發(fā)揮作用

3、的分子機制。此外，本研究旨在探討ATV預(yù)處理能否增加CSCs表面CXCR4和PODXL的表達，并提高其遷移能力及與內(nèi)皮細胞的粘附、穿越作用，進而改善AMI后心功能。
　　方法:首先，分離培養(yǎng)小鼠CSCs，在缺氧無血清條件下用ATV處理12小時，應(yīng)用流式細胞術(shù)和Hoechst33342熒光染色觀察細胞凋亡，并利用Western blot方法檢測通路蛋白AMPK、mTOR的磷酸化水平。其次，設(shè)置不同ATV濃度梯度組及時間梯度組，通過流

4、式細胞術(shù)檢測CSCs細胞表面CXCR4和PODXL的表達比例，確定ATV促進CSCs細胞表面CXCR4和PODXL表達的最佳濃度及時間。通過加入CXCR4的中和抗體及轉(zhuǎn)染PODXL-siRNA阻斷PODXL的表達進行機制研究，進行細胞遷移實驗，細胞粘附實驗和跨內(nèi)皮遷移實驗評價各組CSCs細胞遷移能力，與內(nèi)皮細胞的粘附和穿越能力。最后，在體實驗中將320只雌性C57小鼠隨機分為sham組，AMI組，口服強化ATV組，移植CSCs組，移植A

5、TV預(yù)處理的CSCs(ATV-CSCs)組，口服強化ATV聯(lián)合移植ATV預(yù)處理的CSCs組(ATV+ATV-CS Cs組)，ATV預(yù)處理的轉(zhuǎn)染si-PODXL的CSCs組(ATV-PODXL-SiRNA-CSCs)組、ATV預(yù)處理的轉(zhuǎn)染si-CXCR4的CSCs組(ATV-CXCR4-SiRNA-CSCs)組。采用結(jié)扎冠狀動脈前降支的方法制作急性心肌梗死模型，梗死后1周經(jīng)頸靜脈注射各組處理的CSCs（2×105細胞/只），對照組動物注射

6、等體積PBS。在干細胞移植后3天（基線）及4周（終點）分別行心臟超聲檢測、病理組織學及分子生物學檢測。
　　結(jié)果:缺氧無血清條件引起明顯的細胞凋亡，ATV處理組細胞凋亡率顯著降低，且呈一定的濃度依賴性。ATV處理組AMPK磷酸化水平明顯升高，加入AMPK阻斷劑compound C可以顯著阻斷這種效應(yīng)。ATV可以劑量依賴性促進CSCs表面CXCR4和PODXL的表達，在1μM ATV處理組和預(yù)處理12小時組表達比例最高。細胞遷移實驗

7、顯示，加入CXCR4的中和抗體后CSCs的遷移能力明顯下降， ATV促進CSCs遷移的作用也被顯著抑制。細胞粘附實驗發(fā)現(xiàn)，ATV可以提高CSCs的粘附能力，而阻斷PODXL的表達，會顯著降低CSCs與細胞外基質(zhì)成分的粘附能力，同時也會明顯抵消ATV促進CSCs細胞粘附的作用。在跨內(nèi)皮遷移實驗中，與CSCs組相比，ATV預(yù)處理CSCs組穿越內(nèi)皮細胞層的細胞數(shù)量顯著增加，而轉(zhuǎn)染PODXL-siRNA的CSCs組細胞數(shù)量則顯著減少。
　

8、　結(jié)論:本研究結(jié)果表明ATV具有顯著的抗凋亡作用，可明顯提高CSCs在缺氧無血清條件下的存活率，其作用可能與AMPK/mTOR通路有關(guān)。使用ATV預(yù)處理的CSCs進行細胞移植，可以通過提高CSCs細胞表面CXCR4和PODXL蛋白的表達地促進其歸巢，改善AMI后心功能，聯(lián)合口服強化ATV和ATV預(yù)處理的CSCs可以進一步提高CSCs移植的療效，為提高干細胞移植療效提供了一種新的可能思路。
　　摘要（二） 阿托伐他汀促進急性心肌梗死

9、周邊心肌自噬抑制心肌凋亡的機制研究
　　目的:急性心肌梗死(Acute myocardial infarction，AMI)后局部心肌微環(huán)境惡劣，導致心肌細胞大量丟失，我們課題組的前期研究發(fā)現(xiàn)，他汀可以對缺氧無血清條件下內(nèi)皮細胞及心肌細胞有保護作用。單磷酸腺苷活化蛋白激酶(AMP-activated proteinkinase，AMPK)是調(diào)控細胞能量代謝的核心分子，它可以抑制下游哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian tar

10、get of rapamycin，mTOR)活性，在調(diào)節(jié)細胞凋亡和自噬中發(fā)揮重要作用。本研究擬應(yīng)用Wistar大鼠冠脈結(jié)扎制作AMI模型，給予AMPK抑制劑compound C和ATV進行干預(yù)，對比觀察他汀早期干預(yù)，對梗死后心肌微環(huán)境的影響，明確ATV對梗死周邊區(qū)心肌細胞的凋亡和自噬的調(diào)節(jié)作用及相關(guān)通路。
　　方法:將100只8周齡200-220gWistar大鼠隨機平均分為5組:sham組，AMI組，口服強化ATV組(ATV組)

11、，口服強化ATV并注射compound C組(ATV+CC組)，注射compound C組(CC組)。sham組手術(shù)線穿過前降支，但不結(jié)扎;其余各組開胸行前降支結(jié)扎，其中ATV(10mg/kg/d)和compound C(20mg/kg/w)從AMI模型制備當天開始給予至取材。
　　結(jié)果:超聲數(shù)據(jù)顯示，與AMI組相比，口服ATV組的左室射血分數(shù)(LVEF)有明顯提高;組織病理學檢測顯示，與AMI組相比，口服ATV組的左室纖維化面積

12、和炎性細胞浸潤明顯改善，炎癥因子表達水平降低;此外，口服ATV組凋亡細胞明顯減少，自噬陽性細胞明顯增加。加入AMPK抑制劑compound C后ATV的這些保護作用均被顯著抑制。Western blot結(jié)果顯示，口服ATV組p-AMPK的表達水平較其他幾組明顯上調(diào)，而p-p53和p-mTOR的水平則明顯下調(diào)。
　　結(jié)論:本研究發(fā)現(xiàn)在大鼠急性心梗后4周，ATV可以通過AMPK/mTOR通路顯著促進細胞自噬，抑制細胞凋亡;并且通過激活

13、AMPK/mTOR通路，ATV可以促進心肌存活，減輕炎癥反應(yīng)，改善心功能。
　　摘要（三） 通心絡(luò)調(diào)節(jié)缺氧復氧條件下的人心臟微血管內(nèi)皮細胞蛋白表達及功能的實驗研究
　　目的:在缺血再灌注損傷中，心臟微血管內(nèi)皮細胞(cardiac microvascular endothelialcells，CMECs)通過微循環(huán)控制、旁分泌及近分泌、屏障保護三大功能在局部心肌組織中發(fā)揮保護作用。同時CMECs在缺血再灌注損傷時較心肌細胞更加

14、敏感，更易受到損傷。通心絡(luò)是一種由12種天然藥材構(gòu)成的中藥復方制劑，具有保護內(nèi)皮和防治心肌缺血再灌注損傷的功能。在本實驗中，我們通過CMECs體外缺氧/復氧損傷模型和通心絡(luò)處理，采取TMT(Tandem mass tag)標記的定量蛋白質(zhì)譜方法檢測內(nèi)皮細胞中多種蛋白的變化以及通心絡(luò)的調(diào)節(jié)作用，以便從整體水平系統(tǒng)研究缺氧/復氧損傷對于CMECs細胞內(nèi)蛋白表達的影響以及通心絡(luò)發(fā)揮調(diào)節(jié)作用的相關(guān)機制。
　　方法:以不同濃度的通心絡(luò)處理心

15、臟微血管內(nèi)皮細胞，缺氧2小時，復氧2小時，流式細胞術(shù)分析凋亡率以確定通心絡(luò)作用的最佳濃度。通過TMT標記的蛋白質(zhì)譜法檢測心臟微血管內(nèi)皮細胞在缺氧/復氧后細胞內(nèi)發(fā)生變化的蛋白及通心絡(luò)處理后變化的蛋白，并通過基因本體論分析及文獻綜述發(fā)生變化的蛋白的功能及參與的通路。為進一步驗證差異蛋白功能，我們選取在缺氧/復氧和通心絡(luò)干預(yù)下有顯著變化的蛋白血紅素加氧酶-1(heme oxygenase1，HMOX1)和血管生成素-2(angiopoieti

16、n-2isoform c precursor, ANGPT2)，分別進行抑制和過表達，通過細胞遷移實驗，成管實驗，增殖實驗等進行功能學驗證。
　　結(jié)果:通心絡(luò)濃度依賴性地減少CMECs細胞凋亡，800μg/mL通心絡(luò)的抗凋亡作用最明顯。我們最終在三組中篩選出50個差異蛋白，并且進一步分析了這些蛋白的功能及通路。缺氧/復氧顯著改變CMECs細胞內(nèi)蛋白的表達，而通心絡(luò)的干預(yù)會進一步改變細胞內(nèi)蛋白的表達。與正常組相比，缺氧/復氧組下調(diào)了

17、30種蛋白的表達水平;而與缺氧/復氧組相比，通心絡(luò)干預(yù)組上調(diào)了6種蛋白的表達，下調(diào)了5種蛋白的表達。這些差異蛋白的功能主要包括細胞增殖，應(yīng)激反應(yīng)，調(diào)節(jié)細胞內(nèi)代謝等。我們選取了一些在缺氧/復氧條件下發(fā)揮重要作用的蛋白如HMOX1，ANGPT2等進行進一步分析。在缺氧/復氧條件下，通心絡(luò)顯著抑制CMECs細胞凋亡，促進CMECs細胞增殖，遷移和成管。當同時加入HMOX1抑制劑TiiPPIX或過表達ANGPT2時，細胞凋亡數(shù)量明顯增加，發(fā)生增

18、殖和遷移的細胞數(shù)量，成管長度及血管分支數(shù)均顯著減少。
　　結(jié)論:TMT標記蛋白質(zhì)譜檢測幫助我們從分子水平更深入的了解缺血再灌注損傷機制及通心絡(luò)的調(diào)節(jié)作用。我們確定了CMECs細胞內(nèi)與缺血再灌注損傷相關(guān)的50個差異蛋白，并分析了它們可能參與的多種功能調(diào)節(jié)及通路。缺血再灌注會顯著改變CMECs細胞內(nèi)多種蛋白的表達，而通心絡(luò)干預(yù)會進一步改變這些因子的水平，提示通心絡(luò)可能通過下調(diào)炎癥因子的表達，抑制氧化應(yīng)激因子，調(diào)節(jié)多種細胞內(nèi)代謝活動，發(fā)