超聲微泡介導G-CSF聯(lián)合MSCs移植治療大鼠心肌梗死的實驗研究.pdf

1、本文主要從以下幾個部分展開論述:
　　第一部分 大鼠骨髓源性MSCs的分離、培養(yǎng)與鑒定
　　目的:探討一種可靠、純度高的大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞(mesenchymal stem cells，MSCs)體外提取分離、純化、培養(yǎng)和鑒定的方法。
　　方法:通過密度梯度離心結合貼壁培養(yǎng)技術來分離、純化與培養(yǎng)大鼠骨髓MSCs，同時對其生物學特質(zhì)進行檢測。針對細胞表面的標記分子通過細胞免疫化學以及流式細胞儀進行檢測。
　　結果

2、:所培養(yǎng)的大鼠骨髓MSCs貼壁生長，大多為梭形;CD44于細胞表面高表達，極少見CD45表達，CD34則完全不表達。
　　結論:試驗將Percoll分離液梯度離心密度設定成1.073g/ml，同時借助貼壁純化技術，提純到較高純度的骨髓MSCs。14d通過3代培養(yǎng)會擴增至107細胞數(shù)量級，符合心肌梗死細胞移植種子細胞的要求。
　　第二部分 超聲破壞微泡介導G-CSF促進MSCs歸巢大鼠缺血心肌的實驗研究
　　目的:觀察超

3、聲微泡介導粒細胞集落刺激因子(granulocyte colony-stimulating factor，G-CSF)對大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞歸巢至大鼠心肌缺血區(qū)的效果。
　　方法:將30只心肌梗死(MI)模型制備成功的wistar大鼠隨機分為5組:A:空白對照組(C)，B:單純MSCs組(MSCs)，C:超聲微泡+MSCs組(US/MB+MSCs)，D:超聲微泡+G-CSF組(US/MB+ G-CSF)，E:超聲微泡+G-CSF+

4、 MSCs組(US/MB+G-CSF+MSCs);心梗模型制成后第2天D組和E組給予G-CSF15ug/kg皮下注射，C、D、E組經(jīng)尾靜脈注入聲諾維超聲微泡溶液1ml(濃度約2×108個/ml)，同時進行經(jīng)胸診斷超聲輻照，頻率為5MHz，機械指數(shù)(MI)1.3，輻照5s，間隔5s，共10min，第4天及第6天重復超聲輻照微泡操作，共輻照3次，建模后第7天A組經(jīng)尾靜脈注入1ml生理鹽水作為對照;B組C組
　　和E組經(jīng)尾靜脈注入經(jīng)4，

5、6聯(lián)瞇-2-苯基吲哚(DAPI)標記的細胞懸液(1×107個細胞混懸于2ml PBS中)于2 min內(nèi)緩慢注入，移植后48h，將動物處死，切取心肌梗死邊緣部位組織，對心肌缺血區(qū)域的MSCs分布狀況借助激光共聚焦顯微鏡進行觀察。
　　結果:借助激光共聚焦顯微鏡，發(fā)現(xiàn)相比其它組，超聲微泡+ G-CSF+MSCs組MSCs明顯偏高。
　　結論:MSCs能歸巢至大鼠心肌缺血區(qū)域，超聲微泡介導G-CSF能夠增強其歸巢作用。
　　

6、第三部分 超聲微泡介導G-CSF聯(lián)合MSCs移植治療大鼠心肌梗死的實驗研究
　　目的:對超聲微泡介導G-CSF聯(lián)合MSCs移植治療大鼠心肌梗死的可行性進行研究。
　　方法: 將30只MI模型制備成功的wistar大鼠隨機分為5組:A:空白對照組(C)，B:單純MSCs組(MSCs)，C:超聲微泡+MSCs組(US/MB+MSCs)，D:超聲微泡+G-CSF組(US/MB+G-CSF)，E:超聲微泡+G-CSF+MSCs組(U

7、S/MB+G-CSF+MSCs)。心梗模型制成后第2天D組和E組給予G-CSF 15ug/kg皮下注射，C、D、E組經(jīng)尾靜脈注入聲諾維超聲微泡溶液1ml(濃度約2×108個/ml)，同時經(jīng)胸診斷超聲輻照，頻率為5 MHz，機械指數(shù)(MI) 1.3，輻照5s，間隔5s，共10min，第4天及第6天重復超聲輻照微泡操作，共輻照3次，待完成建模第7d，A組經(jīng)尾靜脈注入1ml生理鹽水作為對照;B組C組和E組經(jīng)尾靜脈注入細胞懸液（1×107個細胞

8、混懸于2ml PBS中）于2min內(nèi)緩慢注入。移植后經(jīng)過28d，對大鼠心臟大小與左心功能進行超聲心動圖檢測，借助免疫組
　　織化學(Immunohistochemistry，IHC)染色技術對CD34及VEGF表達水平進行檢測，計數(shù)微血管密度(Microvessel density，MVD);借助Westernblot與ELISA對VEGF蛋白表達水平進行檢測。
　　結果:超聲心動圖顯示超聲微泡+G-CSF+MSCs組、超聲