G-CSFR在心肌梗死后表達(dá)變化及G-CSF干預(yù)大鼠亞急性期心肌梗死的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、近期的研究表明，G-CSF對(duì)心肌缺血再灌注損傷有一定的心肌保護(hù)作用，G-CSF的作用可能由兩條途徑介導(dǎo)：一是心肌細(xì)胞膜上的G-CSFR；二是增加動(dòng)員骨髓干細(xì)胞。G-CSF對(duì)亞急性期心肌梗死的干預(yù)作用及其機(jī)制目前尚無報(bào)道。本研究通過探索心肌梗死后大鼠心肌組織G-CSF的表達(dá)變化與G-CSFR分布及量的變化，以期尋找在心肌梗死亞急性期進(jìn)行G-CSF干預(yù)的依據(jù)。 第一部分G-CSF及G-CSFR在大鼠急性心肌梗死后的表達(dá)變化

2、方法：結(jié)扎Sprague-Dawley大鼠冠脈前降支，構(gòu)建心肌梗死模型，通過逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(reverse transcription PCR，RT-PCR)檢測梗死心肌G-CSF在不同時(shí)間點(diǎn)(Oh，6h，12h，1d，3d和7d)的mRNA表達(dá)變化。同時(shí)，采用免疫組織化學(xué)技術(shù)了解G-CSFR在梗死后心肌組織的定位，并通過免疫印記法檢測G-CSFR在不同時(shí)間點(diǎn)(1d，3d，5d和7d)的蛋白表達(dá)變化規(guī)律。 結(jié)果：心肌梗死后

3、6小時(shí)，G-CSF在梗死區(qū)域心肌組織內(nèi)的表達(dá)開始增加，在梗死后12小時(shí)達(dá)峰值，1天后逐漸下降至正常水平。免疫組化檢測結(jié)果顯示G-CSFR在心肌梗死后1天僅定位于非梗死區(qū)域，3天后則逐漸在梗死區(qū)域出現(xiàn)陽性染色。免疫印記結(jié)果顯示，隨梗死時(shí)間延長在梗死區(qū)域G-CSFR表達(dá)增加，并在梗死后第5天達(dá)峰值。 結(jié)論：G-CSF在梗死后心肌組織表達(dá)增加，梗死區(qū)域可能通過損傷局部G-CSF的表達(dá)變化與骨髓形成信息交流。G-CSFR的表達(dá)變化較G-

4、CSF稍滯后，心肌梗死后G-CSFR在梗死區(qū)域呈現(xiàn)的表達(dá)變化規(guī)律，為在心肌梗死亞急性期進(jìn)行G-CSF干預(yù)提供了依據(jù)。 心肌梗死后，經(jīng)過心肌壞死，炎性細(xì)胞侵入，肉芽組織階段，最終形成纖維瘢痕。肉芽組織中心肌成纖維母細(xì)胞(cardiacmyofibroblasts，CMF)的凋亡在心肌梗死的修復(fù)進(jìn)程中起著關(guān)鍵作用。在第一部分的研究中發(fā)現(xiàn)G-CSFR在梗死組織表達(dá)增加，本部分將通過體外培養(yǎng)心肌成纖維細(xì)胞(cardiac fibrobl

5、asts，CF)及CMF，觀察CF及CMF是否存在G-CSFR的表達(dá)，并了解G-CSF對(duì)它們遷移與凋亡的影響；構(gòu)建大鼠心梗模型，觀察肉芽組織的演變過程，間質(zhì)細(xì)胞衍生因子(stromal-cell-deftved factor，SDF-1)與CMF的定位關(guān)系；進(jìn)一步通過體外實(shí)驗(yàn)，觀察G-CSF對(duì)CMF中SDF-1表達(dá)的影響。 第二部分G-CSF對(duì)CMF凋亡、SDF-1表達(dá)及CF遷移的影響 方法：建立大鼠心肌梗死模型，通過免

6、疫組化方法觀察梗死區(qū)不同時(shí)間點(diǎn)α-SMA陽性表達(dá)情況。通過免疫雙熒光方法觀察α-SMA與SDF-1在心肌梗死后的表達(dá)定位。進(jìn)行CF及心梗后肉芽組織內(nèi)CMF的體外培養(yǎng)，用RT-PCR．及免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測有無G-CSFR的表達(dá)，并觀察G-CSF對(duì)CF細(xì)胞遷移、CMF凋亡和SDF-1表達(dá)的影響。 結(jié)果：心肌梗死后α-SMA陽性表達(dá)逐漸增多，至7d達(dá)高峰。免疫雙熒光提示α-SMA<'+>與SDF-1<'+>共定位于CMF細(xì)胞。體外培養(yǎng)

7、發(fā)現(xiàn)，CF及CMF細(xì)胞均存在G-CSFR表達(dá)。此外，G-CSF能有效抑制H<,2>O<,2>誘導(dǎo)的CMF細(xì)胞凋亡，增加CMF中SDF-1表達(dá)，并增加CF的遷移能力。 結(jié)論：首次發(fā)現(xiàn)G-CSFR在CMF細(xì)胞表達(dá)；G-CSF減少CMF的凋亡，增加CMF中SDF-1的表達(dá)，并增加CF的遷移能力；G-CSF可能通過上述作用改善亞急性期心肌梗死的心室重構(gòu)。 在前面的研究中發(fā)現(xiàn)，G-CSFR在梗死區(qū)域表達(dá)增加，在體外，G-CSF能明

8、顯抑制CMF凋亡，促進(jìn)CF遷移，增加CMF分泌SDF-1。本部分我們將在體情況下研究G-CSF干預(yù)亞急性期心肌梗死的作用，并進(jìn)一步探討G-CSF對(duì)亞急性期心肌梗死的潛在作用機(jī)制。 第三部分G-CSF干預(yù)大鼠亞急性期心肌梗死的實(shí)驗(yàn)研究 方法：建立大鼠心肌梗死模型，隨機(jī)分為干預(yù)組(T)和對(duì)照組(C)，分別在梗死后3天經(jīng)腹腔注射G-CSF(25 μg/kg/d)或等量生理鹽水，連續(xù)注射5天。分別在以下三個(gè)時(shí)間點(diǎn)處死大鼠進(jìn)行相關(guān)

9、檢測：1、梗死后八天(Tn=4，Cn=4)，免疫印跡觀測SDF-1在兩組中梗死區(qū)域的表達(dá)變化；2、梗死后10天(Tn=5，Cn=5)，取心臟組織切片，行Tunel及Brdu免疫組織化學(xué)檢測，觀察兩組中梗死區(qū)域細(xì)胞凋亡及增殖情況，并用免疫印跡法檢測抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)變化；3、梗死后4周(Tn=5，Cn=6)，分別觀察大鼠非梗死區(qū)域心肌細(xì)胞直徑，梗死區(qū)細(xì)胞α-SMA陽性率，細(xì)胞數(shù)量，膠原形成及梗死周邊的血管生成情況，以評(píng)價(jià)心室重構(gòu)情

10、況。 結(jié)果：梗死后8天，G-CSF干預(yù)組梗死區(qū)SDF-1表達(dá)明顯高于對(duì)照組；梗死后2周，G-CSF干預(yù)組梗死區(qū)域細(xì)胞凋亡率明顯低于對(duì)照組，而細(xì)胞增殖及Bcl-2表達(dá)水平較對(duì)照組高；梗死后4周，干預(yù)組非梗死區(qū)心肌細(xì)胞直徑、膠原形成較對(duì)照組減少，而梗死區(qū)細(xì)胞數(shù)量，梗死周邊血管數(shù)量及α-SMA陽性區(qū)域較對(duì)照組增加。 結(jié)論： G-CSF干預(yù)亞急性期心梗可通過減少梗死區(qū)細(xì)胞凋亡，增加梗死周邊區(qū)域血管生成改善心肌梗死后心室重構(gòu)，增加