PPAR激動(dòng)劑與自體內(nèi)皮祖細(xì)胞聯(lián)合治療急性心肌梗死大鼠的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、背景和目的: 冠心病(Coronary heart disease CHD)特別是急性心肌梗死(Acute MyocardialInfarction AMD是二十世紀(jì)以來(lái)至今的一個(gè)全球性的健康問(wèn)題。隨著人們生活方式的改變，在包括我國(guó)在內(nèi)的發(fā)展中國(guó)家，近年來(lái)急性心肌梗死的發(fā)病率和死亡率也在逐年上升。眾所周知，急性心肌梗死是由于冠狀動(dòng)脈的急性閉塞所導(dǎo)致的，冠脈閉塞引起的缺血缺氧又導(dǎo)致了大量心肌細(xì)胞的喪失。由于心肌細(xì)胞分裂增殖的能力低

2、下，不能很好的修復(fù)壞死的心肌組織，將會(huì)導(dǎo)致心功能的一步步惡化，并且是心肌梗死后病人死亡率和住院率增加的主要原因。雖然心肌梗死被定義為血管性疾病，然而治療策略不能僅僅集中到血管治療還應(yīng)該關(guān)注心肌治療來(lái)促進(jìn)心肌再生改善預(yù)后。越來(lái)越多令人矚目的研究已經(jīng)表明，心肌梗死后通過(guò)移植骨髓來(lái)源的CD34<'+>細(xì)胞或體外擴(kuò)增培養(yǎng)的內(nèi)皮祖細(xì)胞(endothelial progenitor cellsEPCs)可以促進(jìn)缺血組織的血管再生，改善心臟左室功能。

3、以前的研究認(rèn)為EPCs的這種治療作用是通過(guò)分化、增殖為新生血管來(lái)實(shí)現(xiàn)的，最近的報(bào)道認(rèn)為EPCs在體外也可以轉(zhuǎn)分化為有功能的心肌細(xì)胞。并且證實(shí)，在小鼠心肌梗死模型中EPCs可以在體內(nèi)分化為心肌細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞(smooth muscle cells SMCs)，并且可能比單獨(dú)分化為內(nèi)皮細(xì)胞更大程度的促進(jìn)梗死區(qū)域的血流量。因此，內(nèi)皮祖細(xì)胞移植治療心肌梗死可能通過(guò)促進(jìn)血管和心肌再生成為一種新的理想治療方法。EPCs移植治療雖然已經(jīng)取得了很大的

4、成功，然而單純的細(xì)胞移植有一定的局限性，移植細(xì)胞的存活和進(jìn)一步分化成熟很大程度上決定了心功能的改善程度。因此，如果能在細(xì)胞移植期間積極改善EPCs的局部微環(huán)境，抑制炎癥反應(yīng)，減少EPCs凋亡，增強(qiáng)其生存能力，將更能促進(jìn)EPCs對(duì)梗死心肌的修復(fù)和再生作用。本實(shí)驗(yàn)的目的：通過(guò)自體外周血內(nèi)皮祖細(xì)胞移植并聯(lián)合過(guò)氧化物酶體增殖物活化受體α(peroxisome proliferator-activated receptor α，PPAR α)的人

5、工合成激動(dòng)劑非諾貝特(fenofibrate)和過(guò)氧化物酶體增殖劑活化受體γ(peroxisome proliferator-activated receptor γ，PPAR γ)的人工合成激動(dòng)劑羅格列酮(rosiglitazone)來(lái)治療大鼠急性心肌梗死，從而來(lái)評(píng)價(jià)非諾貝特及羅格列酮在聯(lián)合應(yīng)用外周血EPCs移植治療急性心肌梗死的可行性和療效。并且通過(guò)本實(shí)驗(yàn)來(lái)探索非諾貝特(力平之)及羅格列酮(文迪雅)在降血脂和降血糖以外的心血管保護(hù)作

6、用。 方法:選取鄭州大學(xué)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心培育的雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠(150-200g)為研究對(duì)象，飼以正常飲食。隨機(jī)分為四組，每組10只，分為心肌梗死對(duì)照組(組Ⅰ)、單純內(nèi)皮祖細(xì)胞移植組(組Ⅱ)、非諾貝特與內(nèi)皮祖細(xì)胞移植聯(lián)合治療組(組Ⅲ)、羅格列酮與內(nèi)皮祖細(xì)胞移植聯(lián)合治療組(組Ⅳ)。用10﹪的水合氯醛腹腔麻醉大鼠，仰臥位固定在手術(shù)臺(tái)上，無(wú)菌心臟采血3ml，肝素抗凝，用磷酸二氫鹽緩沖液(phosphate

7、 buffer saline，PBS)稀釋1倍后，應(yīng)用Ficoll密度梯度離心的方法獲得單個(gè)核細(xì)胞，種植于纖維連接蛋白包被的培養(yǎng)板上，體外培養(yǎng)擴(kuò)增，獲得較純的EPCs，以5-溴-2′-脫氧嘧啶核苷(5-bromo-2-deoxyuridine，BrdU)標(biāo)記。結(jié)扎大鼠左冠狀動(dòng)脈前降支，制造大鼠急性心肌梗死模型。組Ⅱ、組Ⅲ和Ⅳ組在心梗模型制備后，于梗死周邊區(qū)(心肌顏色蒼白區(qū)周邊)分六點(diǎn)注射內(nèi)皮祖細(xì)胞，每點(diǎn)50μl，組Ⅰ只注射等量培養(yǎng)液。組

8、Ⅲ和組Ⅳ完成上述步驟24h后，分別以非諾貝特20mg/kg/day和羅格列酮4mg/kg/dav灌胃8周。8周后用二維超聲心動(dòng)圖觀察大鼠心功能的改變，8道生理記錄儀測(cè)定血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)。然后處死大鼠，以免疫組化方法檢測(cè)心肌內(nèi)移植的EPCs及大鼠心肌修復(fù)情況。 結(jié)果: (1)心肌梗死模型建立8周后，超聲可見(jiàn)EPCs移植組、EPCs+非諾貝特聯(lián)合治療組和EPCs+羅格列酮聯(lián)合治療組心功能得到明顯改善，射血分?jǐn)?shù)(ejection

9、fraction,EF)、左室短軸縮短率(fractional shortening,FS)較對(duì)照組均有明顯提高(p<0.05)，且EPCs+非諾貝特聯(lián)合治療組和EPCs+羅格列酮聯(lián)合治療組提高更顯著(p<0.05)。 (2)血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)測(cè)定顯示：與對(duì)照組相比，EPCs移植組、EPCs+非諾貝特聯(lián)合治療組和EPCs+羅格列酮聯(lián)合治療組左室收縮壓(Ieft ventricularsystolic pressure,INSP)、壓

10、力變化速率最大值(±dp/dtmax)均明顯升高(p<0.05)，而左室舒張末壓(left ventricular end-diastolic pressure,LVEDP)明顯降低(p<0.05)，且EPCs+非諾貝特聯(lián)合治療組和EPCs+羅格列酮聯(lián)合治療組改變更顯著(p<0.05)，提示左室收縮舒張功能均明顯改善。 (3)細(xì)胞移植8周后BrdU染色發(fā)現(xiàn)(圖5)，在組Ⅱ、組Ⅲ和組Ⅳ的心肌梗死區(qū)域內(nèi)可見(jiàn)BrdU陽(yáng)性移植細(xì)胞分布，

11、提示移植細(xì)胞在心肌組織內(nèi)得以存活，部分細(xì)胞已結(jié)合到新生的血管壁上，參與了局部血管再生過(guò)程。而心肌梗死對(duì)照組(組Ⅰ)未見(jiàn)BrdU陽(yáng)性細(xì)胞分布，且該組梗死區(qū)域纖維化明顯，無(wú)新生細(xì)胞。 結(jié)論: (1)本實(shí)驗(yàn)證實(shí)可以通過(guò)外周血密度梯度離心法分離獲得單個(gè)核細(xì)胞，然后經(jīng)過(guò)一系列體外培養(yǎng)過(guò)程獲得較為純化的內(nèi)皮祖細(xì)胞。 (2)缺血心肌局部移植內(nèi)皮祖細(xì)胞可以通過(guò)促進(jìn)局部心肌組織血管新生，改善冬眠心肌和頓抑心肌的血供來(lái)修復(fù)梗死大鼠的