抗血管內皮生長因子對糖尿病小鼠下肢缺血的治療研究.pdf

1、目的:研究在糖尿病小鼠的下肢缺血模型中，抗血管內皮生長因子對缺血下肢血流的影響及其作用機制。
　　方法:1.糖尿病小鼠的喂養(yǎng):給予普通C57/BL6小鼠高脂高糖飼料，喂養(yǎng)14周，測定其血糖值。2.下肢缺血模型的建立:將小鼠麻醉后，結扎其左下肢股動脈，并且在雙結之間離斷股動脈干支，復溫后，應用激光多普勒掃描儀對小鼠雙下肢血流進行掃描，記錄其血流灌注恢復情況。在結扎前和結扎后(1d)、3d、7d、11d、14d對小鼠雙下肢進行掃描并記

2、錄其血流恢復情況。將實驗小鼠分為四組，糖尿病小鼠對照組、糖尿病小鼠貝伐單抗（血管內皮生長因子抑制劑）組、普通C57/BL6小鼠對照組和普通C57/BL6小鼠貝伐單抗組。各組均為18只小鼠，小鼠經腹腔注射貝伐單抗或生理鹽水，在結扎后(1d)，3d，7d，11d各給予等量的貝伐單抗或生理鹽水一次，在第13天時，尾靜脈注射檢測血管滲漏的熒光染料，利用小動物活體成像儀監(jiān)測小鼠的血管滲漏情況。在第3、7、14d時，各組分別處死6只實驗小鼠，取小鼠

3、下肢雙側腓腸肌。3.蛋白質印跡法檢測待測組織樣品中血管內皮生長因子-A(Vascularendothelial growth factor-A; VEGF-A)的含量:取實驗小鼠腓腸肌，液氮研磨肌肉組織并加入蛋白裂解液和蛋白酶抑制劑制備成蛋白原液，然后根據蛋白質印跡法的步驟進行實驗操作，檢測肌肉組織中VEGF蛋白的表達量。4.應用酶聯免疫吸附試驗（enzyme-linked immu no sorbent assay; ELISA)法對

4、待測組織樣品中VEGF-A、血小板源性生長因子-BB(Platelet derived growth factor-BB;PDGF-BB)的含量進行檢測:按照mouse-PDGF-BB、mouse-VEGF-A ELISA試劑盒操作方法對小鼠腓腸肌樣品進行檢測，檢測其VEGF-A、PDGF-BB的含量。5.RT-PCR分析待測組織中PDGF-BB的表達:按照提取總RNA的實驗方法對組織進行研磨、裂解及提取，然后將提取得到的總RNA逆轉錄

5、為cDNA。最后利用RT-PCR儀分析其目的基因PDGF-BB的表達水平。6.免疫熒光法分析小鼠下肢雙側腓腸肌血管新生及成熟情況:取小鼠下肢腓腸肌，4％多聚甲醛固定，石蠟包埋，制成病理切片，用anti-PECAM-1、anti-NG-2標記血管內皮細胞、血管平滑肌細胞及周細胞，對熒光標記進行統(tǒng)計分析，計算血管新生及周細胞覆蓋程度。7.體外細胞實驗檢測貝伐單抗誘導細胞分泌PDGF-BB的水平:將人臍靜脈血管內皮肌細胞(Human umbi

6、lical vein endothelium cell; HUVEC)分別培養(yǎng)于四個培養(yǎng)皿中，分為4個小組，分別為空白組、貝伐單抗組、VEGF組、貝伐單抗+VEGF組，在無血清培養(yǎng)基情況下，向各組中加入對應刺激因子，培養(yǎng)24小時后，收集細胞做ELISA實驗。8.統(tǒng)計方法:采用spss17.0軟件進行單因素方差分析，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。
　　結果:1.貝伐單抗對小鼠缺血下肢血流恢復的影響:各組小鼠腓腸肌處血流恢復有較大

7、差異，其中，給予貝伐單抗的糖尿病小鼠組血流恢復情況優(yōu)于給予生理鹽水的糖尿病小鼠組。2.蛋白質印跡實驗，給予貝伐單抗的糖尿病小鼠組的VEGF蛋白量低于糖尿病小鼠對照組的VEGF蛋白量。3.待測樣品ELISA結果顯示，糖尿病小鼠對照組缺血側腓腸肌中VEGF-A的蛋白水平明顯高于同時間點的糖尿病小鼠貝伐單抗組VEGF-A的蛋白水平。在第7天時，糖尿病小鼠對照組的VEGF蛋白水平最高。隨著時間的推移，貝伐單抗組的PDGF-BB蛋白含量逐漸升高，

8、并且在第7、14天時，糖尿病小鼠貝伐單抗組的PDGF-BB蛋白水平均高于同時間點糖尿病小鼠對照組的PDGF-BB蛋白水平。4.體外細胞實驗結果顯示:與其他組相比，貝伐單抗刺激人臍靜脈內皮細胞分泌的PDGF-BB無明顯差異。5.RT-PCR結果顯示，糖尿病貝伐單抗組小鼠缺血側中PDGF-BB的表達量高于糖尿病對照組小鼠缺血側PDGF-BB的表達量。6.小動物活體成像結果顯示:在第14天時，糖尿病小鼠貝伐單抗組的血管滲漏程度明顯低于糖尿病小