活血化瘀通絡(luò)中藥對糖尿病大鼠腎臟的保護(hù)作用及其對血管內(nèi)皮生長因子的影響.pdf

1、目的:應(yīng)用鏈脲佐菌素（Streptozotocin，STZ）誘導(dǎo)SD大鼠建立糖尿病(diabetesmellitus，DM)模型，給予活血化瘀通絡(luò)中藥復(fù)方及厄貝沙坦對該模型進(jìn)行干預(yù)，通過觀察大鼠的一般情況、生化指標(biāo)、腎臟病理形態(tài)學(xué)變化以及腎皮質(zhì)組織中血管內(nèi)皮生長因子(vascularendothelialgrowthfactor,VEGF)的表達(dá)水平，來探討VEGF與糖尿病腎病(diabeticnephropathy，DN)的關(guān)系，以及

2、活血化瘀通絡(luò)中藥復(fù)方對糖尿病大鼠腎臟的保護(hù)作用及可能機(jī)制，為臨床上治療糖尿病腎病提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 方法:清潔級(jí)健康雄性SD大鼠48只，體重90-120g，適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后隨機(jī)分為正常組(C)10只，造模組38只。造模組大鼠禁食12h后，一次性腹腔注射STZ55mg/kg，正常組注射等體積枸櫞酸緩沖液。3天后隨機(jī)血糖大于16.7mmol/1的大鼠為造模成功，死亡和未達(dá)標(biāo)者予以剔除。造模成功后，將造模組大鼠隨機(jī)分為模型組(M)1

3、1只，活血化瘀通絡(luò)中藥組(Z)10只，厄貝沙坦組(E)10只。中藥組給予活血化瘀通絡(luò)中藥配方顆粒3.92g/kg/d灌胃，厄貝沙坦組給予厄貝沙坦24mg/kg/d灌胃，正常組及模型組給予等體積純凈水灌胃，每日一次，共16周。于用藥第16周末，收集24h尿液并記錄尿量測定尿蛋白排泄量（UAE）;禁食12h后，麻醉狀態(tài)下稱量體重;腹主動(dòng)脈取血，分離血清，測定糖化血紅蛋白(HbA1c)、血清白蛋白(ALB)、血肌酐(Cr)濃度;摘取右腎，去被

4、膜后稱重以計(jì)算肥大指數(shù)(HI)，切取部分腎皮質(zhì)組織在光鏡和電鏡下觀察腎臟病理改變，免疫組化法觀察腎臟VEGF的表達(dá);摘取左腎，去被膜后切取部分腎皮質(zhì)組織放入凍存管，置于液氮中凍存，用westernblot和Real-timePCR的方法檢測腎臟VEGF的表達(dá)水平。
　　 結(jié)果:
　　 1、實(shí)驗(yàn)大鼠的一般狀況比較
　　 正常組大鼠精神良好，反應(yīng)敏捷，眼睛有神，肌肉豐滿，皮毛光澤柔順，尾不彎曲，無畸形，飲食正常，糞便

5、呈麥粒狀，尿量正常。造模組大鼠均出現(xiàn)明顯的多飲、多食、多尿癥狀，體重相對正常組減輕，并逐漸出現(xiàn)精神萎靡，卷曲拱背，毛色晦暗，尾巴蒼白，少動(dòng)抱團(tuán)。在注射STZ第8周開始出現(xiàn)多種糖尿病并發(fā)癥，如白內(nèi)障、潰瘍、頜下及腋部包塊等，上述癥狀以模型組最為顯著。在第16周時(shí)兩治療組大鼠一般情況較模型組為好。在實(shí)驗(yàn)過程中，不同階段有大鼠死亡情況。注射STZ后72小時(shí)之內(nèi)，2只大鼠死亡，5只大鼠血糖未達(dá)標(biāo)準(zhǔn)，原因可能與大鼠個(gè)體差異和操作有關(guān)，予以剔除。在

6、治療期間，模型組死亡4只，中藥組和厄貝沙坦組大鼠各死亡2只，死亡原因可能為高血糖引起機(jī)體代謝紊亂，最終導(dǎo)致各臟器功能衰竭而死亡。
　　 2、各組大鼠體重，右腎重，肥大指數(shù)（右腎重/體重）的比較
　　 與正常組相比，模型組和兩治療組的體重明顯減輕(P＜0.05)，模型組與兩治療組相比，體重?zé)o明顯差異(P＞0.05)，兩治療組之間體重?zé)o明顯差異(P＞0.05);右腎重各組間均沒有明顯差異(P＞0.05);與正常組相比，模型組

7、和兩治療組肥大指數(shù)明顯升高(P＜0.05)，與模型組相比，兩治療組肥大指數(shù)明顯降低(P＜0.05)，兩治療組之間肥大指數(shù)無明顯差異（P＞0.05）。
　　 3、各組大鼠生化指標(biāo)的比較
　　 3.1、各組大鼠24h尿蛋白定量的比較
　　 與正常組相比，模型組及兩治療組24h尿蛋白定量均明顯升高(P＜0.05);與模型組相比，兩治療組24h尿蛋白定量明顯降低(P＜0.05);兩治療組之間沒有明顯差異(P＞0.05)。

8、
　　 3.2、各組大鼠糖化血紅蛋白的比較
　　 與正常組相比，模型組及兩治療組糖化血紅蛋白均明顯升高(P＜0.05)，模型組和兩治療組以及兩治療組之間無明顯差異(P＞0.05)。
　　 3.3、各組大鼠血清白蛋白的比較
　　 與正常組相比，模型組血清白蛋白明顯降低(P＜0.05)，與正常組和模型組相比，兩治療組均沒有明顯差異(P＞0.05)，兩治療組之間無明顯差異(P＞0.05)。
　　 3.4

9、、各組大鼠腎功能的比較
　　 正常組、模型組及兩治療組之間血肌酐均無明顯差異(P＞0.05)。
　　 4、腎臟病理形態(tài)學(xué)觀察
　　 4.1、光鏡觀察
　　 正常組大鼠腎小球結(jié)構(gòu)清晰完整，未見明顯肥大，毛細(xì)血管腔清晰無擴(kuò)張，基底膜無增厚，系膜無增生，基質(zhì)無明顯改變;模型組大鼠腎小球的毛細(xì)血管球肥大，腎小囊腔呈裂隙狀，基底膜增厚，系膜細(xì)胞增生，系膜基質(zhì)增多，系膜區(qū)增寬;與正常組相比，兩治療組大鼠腎小球也有不同

10、程度的病理改變，但與模型組相比，病變較輕。
　　 4.2、電鏡觀察
　　 正常組大鼠腎小球毛細(xì)血管基底膜結(jié)構(gòu)清晰完整，均勻無增厚，上皮細(xì)胞足突分布均勻、無融合，內(nèi)皮細(xì)胞未見異常，系膜區(qū)未見異常。模型組大鼠腎小球毛細(xì)血管基底膜均質(zhì)性增厚，上皮細(xì)胞足突廣泛融合，內(nèi)皮細(xì)胞融合，系膜區(qū)擴(kuò)大，系膜基質(zhì)增多。兩治療組大鼠腎小球毛細(xì)血管基底膜輕度增厚，足細(xì)胞足突部分融合，系膜基質(zhì)輕度增多。兩治療組間差異不明顯。
　　 5、免疫

11、組織化學(xué)方法檢測腎皮質(zhì)VEGF的表達(dá)
　　 結(jié)果顯示:VEGF在正常組、模型組和兩治療組中均有表達(dá)，主要位于腎小管內(nèi)，以遠(yuǎn)端小管和集合管為主，在近端小管也有表達(dá)，而在腎小球內(nèi)只有少量表達(dá)或基本無表達(dá)。半定量分析結(jié)果顯示:與正常組相比，模型組及兩治療組VEGF的表達(dá)明顯增強(qiáng)(P＜0.05);與模型組相比，兩治療組VEGF的表達(dá)明顯降低(P＜0.05);兩治療組間無明顯差異(P＞0.05)。
　　 6、實(shí)時(shí)定量PCR方法檢測

12、腎皮質(zhì)VEGFmRNA的表達(dá)
　　 與正常組相比，模型組和兩治療組腎皮質(zhì)VEGFmRNA表達(dá)水平均明顯增高(P＜0.05);與模型組相比，兩治療組腎皮質(zhì)VEGFmRNA表達(dá)水平均明顯降低(P＜0.05);兩治療組間無明顯差異(P＞0.05)。
　　 7、Western-blot方法檢測腎皮質(zhì)VEGF的表達(dá)
　　 與正常組相比，模型組和兩治療組腎皮質(zhì)VEGF表達(dá)水平均明顯增高(P＜0.05);與模型組相比，兩治療組

13、腎皮質(zhì)VEGF表達(dá)水平均明顯降低(P＜0.05);兩治療組間無明顯差異(P＞0.05)。
　　 結(jié)論:
　　 1、糖尿病大鼠成模后16周可出現(xiàn)早期糖尿病腎病表現(xiàn)。此時(shí)，腎皮質(zhì)組織中VEGF表達(dá)已明顯升高。
　　 2、活血化瘀通絡(luò)中藥復(fù)方可以減少糖尿病大鼠尿蛋白的排泄，減輕腎臟病理損害，延緩糖尿病腎病的發(fā)生和發(fā)展。
　　 3、活血化瘀通絡(luò)中藥復(fù)方可以抑制糖尿病腎病大鼠腎皮質(zhì)組織中VEGF的過表達(dá)，此作用與厄