活血化瘀通絡(luò)中藥對(duì)糖尿病胃輕癱大鼠RhoA-ROCK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的影響.pdf

1、目的:糖尿病胃輕癱(DGP)是一種繼發(fā)于糖尿病(DM)基礎(chǔ)上，以惡心、發(fā)作性嘔吐、厭食、早飽感及餐后腹脹為主要臨床表現(xiàn);在排除胃機(jī)械性梗阻的條件下出現(xiàn)胃擴(kuò)張、胃蠕動(dòng)減慢和胃排空延遲[1]，是糖尿病患者常見(jiàn)的一種并發(fā)癥，嚴(yán)重危害患者的身體健康。據(jù)報(bào)道糖尿病患者DGP發(fā)病率高達(dá)30％-50％[2-4]。近年來(lái)國(guó)內(nèi)外對(duì)糖尿病胃輕癱發(fā)病機(jī)制的報(bào)道眾多，主要是與神經(jīng)病變、高血糖、胃腸激素紊亂、Cajal間質(zhì)細(xì)胞(ICC)病變、微血管病變、胃腸平滑

2、肌病變等因素有關(guān)。
　　近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)胃腸平滑肌病變?cè)谔悄虿∥篙p癱的發(fā)生發(fā)展中起到非常重要的作用。胃腸道平滑肌是胃腸道動(dòng)力的核心單位，各種因素最終都要通過(guò)胃腸道平滑肌來(lái)發(fā)揮調(diào)控胃腸道動(dòng)力的作用。目前認(rèn)為糖尿病胃輕癱大鼠中存在胃電-機(jī)械失偶聯(lián)的現(xiàn)象即提示DGP大鼠胃竇平滑肌本身可能存在異常。RhoA/ROCK信號(hào)通路是一種Ca2+非依賴(lài)性的平滑肌收縮調(diào)節(jié)機(jī)制，其主要的效應(yīng)分子還包括肌球蛋白輕鏈磷酸酶(MLCP)、肌球蛋白輕鏈激酶(M

3、LCK)及磷酸化的肌球蛋白輕鏈(p-MLC)等，該信號(hào)通路激活后可以調(diào)節(jié)平滑肌的收縮。目前發(fā)現(xiàn)其與血管平滑肌、膀胱平滑肌、子宮平滑肌等的異常收縮有密切關(guān)系，研究[5]發(fā)現(xiàn)RhoA/ROCK的過(guò)表達(dá)可以加重糖尿病心肌病，引起血管平滑肌收縮異常，可以參與血管內(nèi)皮細(xì)胞收縮，增強(qiáng)內(nèi)皮細(xì)胞通透性[6]。但是RhoA/ROCK信號(hào)通路與胃平滑肌關(guān)系及其是否參與DGP的發(fā)病目前尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)旨在觀察活血化瘀通絡(luò)中藥對(duì)糖尿病胃輕癱大鼠胃排空率及胃平滑

4、肌病變及對(duì)RhoA/ROCK信號(hào)通路的影響，探討其治療DGP可能作用機(jī)制，為臨床治療糖尿病胃輕癱提供理論依據(jù)。
　　方法:清潔級(jí)健康雄性(Sprague Dawley) SD大鼠30只，體重為201-205g，適應(yīng)性飼養(yǎng)大鼠2周后按體重隨機(jī)分正常組、模型組和中藥組，中藥組干預(yù)的藥物是由丹參、水蛭、地龍、川芎等中藥組成。于正常組和模型組大鼠的腹腔給予注射鏈脲佐菌素(STZ)25 mg/kg，注射前STZ的使用按照1％比例用檸檬酸緩沖

5、液(pH4，0.1 mmol/L)進(jìn)行稀釋。注射STZ后的72 h及1wk時(shí)，于大鼠的尾靜脈處進(jìn)行采血，只有大鼠的隨機(jī)血糖不低于16.7 mmol/L時(shí)，方能確定動(dòng)物造模成功。確定造模成功后，用生理鹽水對(duì)正常組和模型組的大鼠進(jìn)行灌胃，中藥組予活血化瘀通絡(luò)中藥灌胃，灌藥的比例為10ml/(kg·d);每天灌胃一次，共進(jìn)行6周。于第6周末時(shí)候，給予大鼠酚紅溶液灌胃，15分鐘后按2ml/kg體重腹腔注射8％異戊巴比妥鈉麻醉，然后剖開(kāi)大鼠腹腔，

6、結(jié)扎大鼠賁門(mén)及幽門(mén)，取出整個(gè)胃部，用來(lái)檢測(cè)胃排空率;留取部分胃組織，置于4％多聚甲醛固定液中，蘇木素伊紅（HE）染色法觀察大鼠胃組織的形態(tài)學(xué)改變;部分胃組織于液氮速凍后置于-80℃低溫冰箱內(nèi)保存，RT-PCR法檢測(cè)大鼠胃組織中RhoA、ROCK1、ROCK2的基因表達(dá)情況，蛋白印跡(Western blot)法檢測(cè)胃組織中p-MLC的蛋白表達(dá)。
　　結(jié)果:
　　1、大鼠一般狀況比較
　　正常組大鼠的飲食正常，營(yíng)養(yǎng)狀況良

7、好，反應(yīng)敏捷，毛色有光澤，體重逐漸增加;其他兩組的大鼠的表現(xiàn)出多飲、多食、多尿癥狀，營(yíng)養(yǎng)狀況較差，反應(yīng)遲鈍，精神不振，毛色無(wú)光澤，且模型組死亡2只大鼠。但是中藥組大鼠的一般狀況比模型組大鼠較好，飲食、營(yíng)養(yǎng)及反應(yīng)都尚可。
　　2、各組大鼠血糖及體質(zhì)量的比較
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，與正常組相比，模型組、中藥組大鼠的體質(zhì)量明顯下降(P＜0.05）;與模型組相比，中藥組大鼠的體質(zhì)量明顯增加(P＜0.05）。與正常組相比，模型組、中藥組大鼠

8、的血糖值明顯增加(P＜0.05）;與模型組相比，中藥組大鼠的血糖值明顯下降(P＜0.05）。
　　3、各組大鼠胃排空率的比較
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，與正常組相比，模型組、中藥組大鼠的胃排空率明顯下降(P＜0.05);與模型組相比，中藥組大鼠的胃排空率明顯增強(qiáng)(P＜0.05)。
　　4、HE染色結(jié)果
　　正常組大鼠的胃粘膜層次結(jié)構(gòu)清楚，腺體排列整齊，血管豐富，平滑肌細(xì)胞呈梭形，細(xì)胞核規(guī)則，細(xì)胞核膜平滑，細(xì)胞密體明顯，未見(jiàn)

9、細(xì)胞空泡;與正常組相比，模型組大鼠的胃粘膜層次結(jié)構(gòu)欠清，腺體排列紊亂，血管數(shù)量減少，平滑肌細(xì)胞變小，部分細(xì)胞凹陷，胞核不規(guī)則，細(xì)胞核褶皺，細(xì)胞密體減少，出現(xiàn)空泡樣變性，基底膜增厚;中藥干預(yù)組大鼠的胃粘膜層次結(jié)構(gòu)較清楚，腺體排列較尚齊，血管數(shù)量較豐富，平滑肌細(xì)胞多呈梭形，細(xì)胞核較規(guī)則，細(xì)胞密體較明顯，少量細(xì)胞空泡，基底膜未增厚。
　　5、各組大鼠胃組織RhoA mRNA、ROCK1mRNA、ROCK2mRNA的表達(dá)
　　與正常

10、組相比，模型組及中藥組大鼠胃組織中RhoA mRNA的表達(dá)水平顯著降低(P＜0.05);與模型組相比，中藥組RhoA mRNA的表達(dá)升高（P＜0.05）。
　　與正常組相比，模型組及中藥組大鼠胃組織中ROCK1mRNA的表達(dá)水平顯著降低(P＜0.05);與模型組相比，中藥組ROCK1 mRNA的表達(dá)升高（P＜0.05）。
　　與正常組相比，模型組及中藥組大鼠胃組織中ROCK2mRNA的表達(dá)水平顯著降低(P＜0.05);與模型

11、組相比，中藥組ROCK2 mRNA的表達(dá)均升高（P＜0.05）。
　　6、各組大鼠胃組織p-MLC蛋白的表達(dá)
　　與正常組相比，模型組及中藥組大鼠胃組織中p-MLC蛋白的表達(dá)水平顯著降低(P＜0.05);與模型組相比，中藥組p-MLC蛋白的表達(dá)升高(P＜0.05)。
　　結(jié)論:
　　1、糖尿病胃輕癱大鼠存在明顯的胃排空障礙;活血化瘀通絡(luò)中藥能改善胃排空率，對(duì)糖尿病胃輕癱有良好的治療作用。
　　2、糖尿病胃輕