大鼠腎臟缺血再灌注損傷中性激素對(duì)RhoA-ROCK信號(hào)通路的影響.pdf

1、目前研究表明.腎臟的缺血再灌注損傷存在性別差異.通常,性別差異最初被解釋為雌激素介導(dǎo)的對(duì)病理?yè)p傷的保護(hù)作用.然而最近研究報(bào)道,在缺血再灌注損傷中,雄激素起著比雌激素更為重要的作用.另外,有人提出腎臟的缺血再灌注損傷可能與性激素的平衡狀態(tài)有關(guān).Rho/ROCK信號(hào)通路參與心腦血管的缺血再灌注損傷,Rho激酶(Rho-associated kirmse,ROCK)抑制劑能夠改善這種損傷,并且也能改善腎臟缺血再灌注損傷.然而,Rho/ROCK

2、信號(hào)通路參與腎臟的缺血再灌注損傷是否存在性別差異;Rho/ROCK信號(hào)通路參與腎臟的缺血再灌注損傷是否與性激素平衡狀態(tài)有關(guān)仍未得到證實(shí).本研究制備不同性別大鼠腎臟缺血再灌注損傷模型及不同性激素水平腎臟缺血再灌注損傷大鼠模型,觀察RhoA/ROCK信號(hào)通路參與腎臟缺血再灌注損傷是否存在性別差異;RhoA/ROCK信號(hào)通路參與腎臟缺血再灌注損傷是否與性激素及其平衡狀態(tài)有關(guān);ROCK的特異性阻斷劑鹽酸法舒地爾是否能夠阻止腎臟的缺血再灌注損傷,

3、這種阻斷作用是否與性激素平衡狀態(tài)有關(guān).根據(jù)實(shí)驗(yàn)內(nèi)容我們把實(shí)驗(yàn)分為兩個(gè)步驟進(jìn)行研究:1.RhoA/ROCK信號(hào)通路在大鼠腎臟缺血再灌注損傷中的作用的性別差異.2.RhoA/ROCK信號(hào)通路在不同性激素水平大鼠腎臟缺血再灌注損傷中作用. 方法 1.RhoA/ROCK信號(hào)通路在大鼠腎臟缺血再灌注損傷中的作用的性別差異應(yīng)用2.5月齡wistar大鼠建立腎臟缺血再灌注損傷模型(雄鼠:10只;雌鼠:10只).大鼠隨機(jī)分為4個(gè)實(shí)驗(yàn)組(

4、每組5只).(1)雄鼠假缺血再灌注組(SM);(2)雌鼠假缺血再灌注組(SF);(3)雄鼠缺血再灌注組(IM);(4)雌鼠缺血再灌注組(IF).術(shù)前、術(shù)后常規(guī)取血檢測(cè)血清肌酐(Creatinine,Cr)、尿素氮(blood urea nitrogen,BUN)水平;腎組織石蠟切片常規(guī)病理PAS染色及免疫組化染色,半定量分析腎小管損傷情況,并觀察ROCK活性的特異性分子標(biāo)記磷酸化膜突蛋白(phosphorylated moesin,p-

5、Moesin)的免疫組化定位及其表達(dá)情況;應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄酶聯(lián)反應(yīng)技術(shù)(reverse transcription polymerasechainreaction,RT-PCR)檢測(cè)腎組織RhoA and ROCK mRNA的表達(dá);應(yīng)用Westernblot檢測(cè)腎組織RhoA蛋白和p-Moesin的表達(dá).2.RhoA/ROCK信號(hào)通路在不同性激素水平大鼠腎臟缺血再灌注損傷中作用應(yīng)用2.5月齡Wistar大鼠建立不同性激素水平大鼠模型(雄性:4

6、0只;雌鼠:30只).大鼠隨機(jī)分為7個(gè)實(shí)驗(yàn)組(每組10只,每組隨機(jī)分為模型組和治療組各5只): (1)正常雄鼠缺血再灌注加安慰劑組(IMV); (2)去勢(shì)雄鼠缺血再灌注加丙酸睪丸酮組(CMT);(3)去勢(shì)雄鼠缺血再灌注加安慰劑組(CMV);(4)去勢(shì)雄鼠缺血再灌注加17 β-雌二醇組(CME);(5)去勢(shì)雌鼠缺血再灌注加安慰劑組(OFV);(6)去勢(shì)雌鼠缺血再灌注加17 β-雌二醇組(OFE);(7)正常雌鼠缺血再灌注加安慰劑組(IFV

7、).不同性激素水平大鼠模型制備成功后,再建立大鼠腎臟缺血再灌注損傷模型.每組隨機(jī)選取5只大鼠在缺血再灌注前5分鐘腹腔注射鹽酸法舒地爾.術(shù)前、術(shù)后常規(guī)取血檢測(cè)血清睪酮、雌二醇、肌酐(Cr)、尿素氮(BUN)水平;腎組織石蠟切片常規(guī)病理PAS染色,半定量分析腎小管損傷情況;應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)技術(shù)檢測(cè)腎組織內(nèi)RhoA和ROCK mRNA的表達(dá);應(yīng)用Western blot檢測(cè)腎組織RhoA蛋白和p-Moesin的表達(dá).結(jié)果1

8、.RhoA/ROCK信號(hào)通路在大鼠腎臟缺血再灌注損傷中的作用的性別差異1.1各組大鼠'腎功能分析結(jié)果與假手術(shù)組相比,手術(shù)組大鼠血清BUN和Cr水平顯著升高(p＜0.05);在手術(shù)組大鼠中,雄鼠血清BUN和Cr水平顯著高于雌鼠(P<0.05).1.2腎組織形態(tài)學(xué)變化與假手術(shù)組相比,手術(shù)組雄鼠和雌鼠腎臟近曲小管均出現(xiàn)不同程度的缺血壞死(3.8±0.45 vs 0:2.2±0.84 vs 0:p<0.01).在手術(shù)組中,雄鼠腎小管損傷明顯重于

9、雌鼠(3.8±0.45 vs 2.2±0.84,P<0.05). 1.3免疫組化結(jié)果p-Moesin定位于腎小管上皮細(xì)胞胞漿和胞核,腎臟缺血再灌注損傷后p-Moesin表達(dá)較假手術(shù)組增多(3.4±0.45 vs 1.2±0.55:2.2±0.55 vs 1.4±0.45 vs;P<0.05),并且手術(shù)組雄鼠腎小管p-Moesin的表達(dá)高于雌鼠(3.4±0.45 vs 2.2±0.55:P<0.05). 1.4 RT-PC

10、R和Western Blot假手術(shù)組大鼠腎臟RhoA、ROCK mRNA和RhoA蛋白、p-Moesin的表達(dá)在雄鼠和雌鼠之間沒有顯著差異(P>0.05);腎臟缺血再灌注損傷后表達(dá)均上調(diào)(P<0.05).在手術(shù)組中,雄鼠和雌鼠腎臟RhoA、ROCK mRNA的表達(dá)沒有顯著差異(P>0.05),而雄鼠腎臟RhoA蛋白、p-Moesin的表達(dá)明顯高于雌鼠(P<0.05). 2.RhoA/ROCK信號(hào)通路在不同性激素水平大鼠腎臟缺血再

11、灌注損傷中作用2.1各組大鼠血清性激素水平變化情況組內(nèi)大鼠雌雄激素水平均無(wú)明顯差異(P>0.05);去勢(shì)后大鼠無(wú)論給予17 β-雌二醇還是丙酸睪丸酮,其血清雌二醇和睪酮濃度均升高,但是,其血清的異性激素水平仍低于異性大鼠.雄鼠去勢(shì)后血清睪酮濃度下降約10倍,但血清雌二醇水平與對(duì)照組沒有明顯差異.雌鼠去勢(shì)后血清雌二醇濃度下降了7倍,但血清睪酮水平與對(duì)照組沒明顯差異.我們發(fā)現(xiàn)各組之間血清雌二醇和睪酮濃度的比率從IMV組到IFV組(表1)逐漸

12、上升. 2.2血清Cr、BUN濃度和血清性激素水平的關(guān)系模型組和治療組血清Cr濃度均與雌/雄激素比率呈明顯的負(fù)相關(guān)關(guān)系(r=-0.834,P<0.05:r=-0.764,P<0.05);模型組和治療組血清BUN濃度與雌/雄激素比率也有一定的相關(guān)性(r=-0.693,P<0.05;r=-0.635,P<0.05). 2.3腎組織形態(tài)學(xué)變化各缺血再灌注組大鼠腎臟近曲小管均出現(xiàn)不同程度的缺血壞死,并且壞死隨雌/雄激素比率的增加

13、逐漸減輕,鹽酸法舒地爾治療組.腎小管損傷有所改善.各模型組和治療組腎小管損傷評(píng)分為:IMV組(3.8±0.45 vs 3.8±0.45)、CMT組(3.6±0.55 vs 3.6±0.89)、CMV組(3.4±0.89 vs 2.8±0.45)、CME組(3.2±0.84 vs 2.6±0.89)、OFV組(2.8±0.45 vs 1.8±0.45)、OFE組(2.6±0.89 vs 1.6±0.55)、IFV組(2.2±0.84 vs

14、 1.2±0.84),在OFV組、OFE組、IFV組中,模型組與相應(yīng)的治療組之間比較均有顯著差異(p<0.05).2.4 RT-PCR和Western Blot不同性激素水平大鼠腎臟缺血再灌注后,RhoA蛋白、p-Moesin的表達(dá)隨血清雌/雄激素比率的增加而逐漸降低;治療組RhoA蛋白和p-Moesin的表達(dá)較相應(yīng)的模型組降低,并且也隨血清雌/雄激素比率的增加而逐漸降低.在OFV組、OFE組、IFV組中,模型組與相應(yīng)的治療組之間比較均

15、有顯著差異(p<0.05).治療組和模型組RhoA和ROCK mRNA的表達(dá)在不同性激素水平腎臟缺血再灌注大鼠之間沒有顯著差異(p>0.05). 結(jié)論 1.大鼠腎臟缺血再灌注損傷存在性別差異; 2.RhoA/ROCK信號(hào)通路參與大鼠腎臟缺血再灌注損傷存在性別差異; 3.RhoA/ROCK信號(hào)通路參與腎臟缺血再灌注損傷與性激素的平衡狀態(tài)有關(guān); 4.性激素平衡狀態(tài)是從蛋白水平而不是基因水平影響RhoA