復方腎華片對腎缺血再灌注損傷大鼠腎臟保護作用及對Toll樣受體信號通路的研究.pdf

1、目的:缺血再灌注損傷(ischemia-reperfusion injury,IRI)是指組織或器官在缺血的基礎上恢復血流后,細胞功能代謝發(fā)生障礙及結構損傷反而加重的現(xiàn)象。急性腎損傷(Acute kidney injury,AKI)是臨床的常見疾病,其患病率逐年攀升,AKI的定義為48h內血肌酐(Serum creatinine,Scr)升高≥26.5umol/L;或者Scr增加≥基線值的1.5倍;或持續(xù)6h尿量<0.5ml/kg·h。

2、其發(fā)病機制尚未完全清楚。腎IRI是導致缺血性AKI的主要原因之一。研究表明,免疫炎癥反應是IRI的重要機制之一,其中炎性受體發(fā)揮著重要作用。Toll樣受體(Toll-like receptors,TLRs)是近年來發(fā)現(xiàn)的I型跨膜蛋白受體。它可以針對不同病原相關分子模式或損傷相關分子模式進行識別、結合,引發(fā)一系列細胞內信號傳導,進而導致炎性介質的釋放,最終導致免疫炎癥反應的發(fā)生。
　　有證據表明TLRs是參與激發(fā)缺血后免疫炎癥反應的

3、主因,是組織損害的關鍵性傳感器。大量的實驗數據支持TLRs作為炎癥和自身免疫性疾病的一個新靶點。阻斷或抑制TLRs信號通路節(jié)點藥物研究已成為醫(yī)學領域的熱點。但目前西藥對腎IRI的防治尚無有效的方法。千百年來中藥在辨證治療方面發(fā)揮了不可或缺的作用,中藥方劑的功效研究正吸引世界各地學者越來越多的關注。
　　本文通過建立大鼠腎IRI模型,探討中藥復方制劑復方腎華片(Fufang Shenhua Tablet,SHT)高、低兩種劑量對IR

4、I模型大鼠發(fā)生的AKI的腎臟保護作用,同時觀察IRI術后1周內Toll樣受體2(Toll-like receptor 2,TLR2)和Toll樣受體4(Toll-like receptor 4,TLR4)及相關的炎癥細胞因子的蛋白及mRNA表達,以及TLRs信號傳導通路中髓樣細胞分化因子(myeloid differentiation factor 88,MyD88)的蛋白及mRNA表達。從TLRs信號傳導通路改變上來揭示SHT對IRI

5、大鼠的腎臟保護作用及其可能的機制。
　　方法:(1)首先通過采用無創(chuàng)動脈夾夾閉大鼠的雙側腎蒂方式來建立Wistar大鼠腎IRI模型,根據腎臟缺血的時間不同,大鼠隨機分成假手術組(Sham組)、20min組、30min組、40min組及50min組,缺血再灌注1d后用全自動生化測定儀檢測大鼠血肌酐(Serumcreatinine,Scr)、尿素氮(blood urea nitrogen,BUN);大鼠腎臟組織制作石蠟切片,PAS染色

6、后光學顯微鏡下觀察腎小管的損傷程度。用顯微圖像采集分析系統(tǒng)對大鼠腎臟病理組織形態(tài)學的變化和腎小管損傷程度進行評分,比較不同的缺血時間對腎臟的上述指標的影響;同時進行大鼠腎缺血50min組的術后1周生存率觀察。在確定理想的大鼠腎缺血時間后,將Wistar大鼠隨機分成兩組,一組將右側腎切除,左側腎蒂夾閉;另一組行雙側腎蒂夾閉。觀察術后1d、3d、5d、7d血肌酐、尿素氮變化以及術后1周大鼠生存率,繪制生存率曲線。篩選出理想的大鼠IRI模型所

7、需的術式和腎蒂缺血夾閉時間。
　　(2)將大鼠隨機分為4組:假手術組(Sham)、模型對照組(Model)、復方腎華片低劑量組(SHT-L)和復方腎華片高劑量組(SHT-H)。給予治療藥物每天灌胃1次,7天后采用雙側腎蒂夾閉40min方法建立腎IRI模型,觀察大鼠術后24h和72h生命體征;用全自動生化測定儀檢測血BUN、Scr;光學顯微鏡下觀察大鼠腎組織的腎小管損傷程度,并用計算機顯微圖像采集分析系統(tǒng)對腎小管損傷程度進行評分。觀

8、察和評估復方腎華片(SHT)的腎臟保護作用。
　　(3)將大鼠隨機分為5組:假手術組(Sham)、模型對照組(Model)、黃芪甲苷組(Astragaloside)、復方腎華片低劑量組(SHT-L)和復方腎華片高劑量組(SHT-H)。給予相應藥物每天灌胃1次,7天后采用右腎切除,左側腎蒂夾閉40min方法建立腎IRI模型,觀察術后24h和72h大鼠的生命體征;用全自動生化測定儀檢測血BUN、Scr;光學顯微鏡下觀察大鼠腎組織的腎小

9、管損傷程度,并用顯微圖像采集分析系統(tǒng)對腎小管損傷程度進行評分;JEM-1400型電子顯微鏡觀察腎小管上皮細胞超微結構變化,并作量化分析。
　　(4)將大鼠隨機分為5組:假手術組(Sham)、模型對照組(Model)、黃芪甲苷組(Astragaloside)、復方腎華片低劑量組(SHT-L)和復方腎華片高劑量組(SHT-H),分別給予相應藥物灌胃7天后,采用右側腎切除,左側腎蒂夾閉40min法建立缺血再灌注模型,通過石蠟切片免疫組織

10、化學ABC法(Immunohistochemistry,IHC-P)、蛋白印跡法(Western blot,WB)和ABI7900HT實時熒光定量核酸擴增檢測系統(tǒng)(Real-time quantitative PCR detecting system,qPCR)檢測大鼠術后1d、3d、5d、7d腎組織Toll樣受體2(Toll-likereceptors2,TLR2)、Toll樣受體4(Toll-like receptors 4,TLR

11、4)、髓樣分化因子88(myeloid differentiation factor 88,MyD88)、白細胞介素-6(interleukin 6,IL-6)和白細胞介素-12(interleukin 12,IL-12)蛋白分子及其mRNA水平表達,白細胞介素-8(interleukin 8,IL-8)和干擾素-γ(IFN-gamma,IFN-γ)的蛋白表達情況。
　　結果:(1)實驗中手術造模成功率達97.6％,與Sham組相

12、比,雙側腎蒂夾閉30min組,再灌注1d后血尿素氮、肌酐及腎臟病理損害評分均升高(P<0.05),而20min組上述指標均無顯著性差異(P>0.05)。與Sham組相比,雙側腎蒂夾閉40min組和50min組,再灌注1d后血尿素氮、肌酐和腎臟病理損害評分均顯著異常(P<0.01)。右側腎切除,左側腎蒂夾閉組與雙側腎蒂夾閉組比較,術后1周兩組間血肌酐和生存率無顯著差異(P>0.05)。腎缺血50min組的生存率下降顯著,僅為50%。

13、>　　(2)與Sham組相比,術后24h和72h,Model組大鼠的腎功及腎臟病理均顯著異常(P<0.01)。與Model組相比,術后24h和72h,SHT-L組大鼠的腎功及腎組織病理損害均減輕(P<0.05),SHT-H組腎功及腎組織病理損害減輕更明顯(P<0.01);SHT-H組大鼠的腎功及腎組織病理損害均輕于SHT-L組(P<0.05)。
　　(3)IRI術后24h,腎功、腎臟光鏡和電鏡病理損害達峰值,術后72h上述指標均得

14、到部分恢復。術后24h和72h,Astragaloside組和SHT-L組腎功、腎臟光鏡和電鏡病理損害均較Model組顯著改善(P<0.05),SHT-H組改善更顯著(P<0.01);Astragaloside組和SHT-L組上述指標結果相似(P>0.05),SHT-H組上述指標改善程度優(yōu)于Astragaloside組和SHT-L組(P<0.05)。
　　(4)與Model組相比,大鼠IRI術后1d、3d、5d、7d,Astrag

15、aloside組和SHT-L組TLR2和TLR4蛋白分子及mRNA表達均降低(P<0.05),SHT-H組TLR2和TLR4蛋白分子及mRNA表達下降最顯著(P<0.01)。各組大鼠IRI術后5dTLR2和TLR4蛋白分子及mRNA表達均達峰值;與Astragaloside組和SHT-L組比較,IRI術后1d、3d、5d、7d,SHT-H組TLR2和TLR4蛋白分子及mRNA表達均明顯下降(P<0.05);Astragaloside組和

16、SHT-L組TLR2和TLR4蛋白分子及mRNA表達無差異(P>0.05)。與Model組相比,大鼠IRI術后1d、3d、5d、7d,Astragaloside組、SHT-L組和SHT-H組IL-6、IL-12和MyD88蛋白分子及mRNA表達均顯著降低(P<0.05)。術后1dIL-8和TNF-γ蛋白表達水平最高,術后3dIL-6、IL-12蛋白分子及mRNA表達水平達峰值,術后5d各組MyD88蛋白分子及mRNA表達水平達峰值。術后

17、1d、3d、5d、7d,與Astragaloside組和SHT-L組比較,SHT-H組MyD88蛋白分子及mRNA表達,以及IL-8和IFN-γ蛋白表達均明顯下降(P<0.05);Astragaloside組和SHT-L組比較,無論MyD88蛋白分子和mRNA表達,還是IL-8和TNF-γ蛋白表達,兩組均無顯著差異(P>0.05)。
　　結論:(1)采用無創(chuàng)動脈夾夾閉大鼠腎蒂的方法可以制備穩(wěn)定的腎IRI模型,大鼠造模較為理想的腎缺

18、血時間是40min,右側腎切除,左側腎蒂夾閉法與雙側腎蒂夾閉法造模均可行,術后生存率較高,所得模型效果滿意。(2)無論是中藥復方(SHT)還是單味中藥(Astragaloside)均可明顯改善腎IRI大鼠的生存質量,保護腎臟功能,減輕腎臟病理損害,其中低劑量SHT與Astragaloside療效相似,但高劑量SHT療效優(yōu)于Astragaloside,提示中藥復方優(yōu)于單味中藥。(3)SHT可抑制腎IRI大鼠免疫炎癥受體TLR2和TLR4的