吡格列酮和胰島素對大鼠骨髓內(nèi)皮祖細胞的影響.pdf

1、研究背景和目的：
　　近年來，包括內(nèi)皮祖細胞（EPCs）在內(nèi)的成體干細胞的研究為冠心病和糖尿病等心血管疾病的治療開啟了一個新的方向。EPCs來源于骨髓，表達AC133、CD34、VEGFR-2(flk-1)等表面標志，可以通過分泌生長因子或通過歸巢到內(nèi)皮損傷及缺血部位，直接分化、發(fā)育為內(nèi)皮細胞并形成新生血管，因而在內(nèi)皮損傷后修復(fù)及心肌梗死后血運重建中起著重要的作用。
　　研究表明，循環(huán)EPCs數(shù)量可作為預(yù)測血管功能和心血管疾

2、病危險因素的指標，其數(shù)量減少提示血管內(nèi)皮修復(fù)能力降低，心血管疾病發(fā)生率增高。冠心病和糖尿病（1型和2型）患者循環(huán)EPCs數(shù)量減少，其增殖、遷移、歸巢和成血管能力降低[3-5]。故用藥物增加EPCs數(shù)量并改善其功能，進而促進心血管疾病患者的血管內(nèi)皮修復(fù)和血管新生，成為治療心血管疾病的新策略。胰島素可以激活內(nèi)皮型一氧化氮合酶（eNOS），刺激一氧化氮（NO）產(chǎn)生，導(dǎo)致血管舒張。而eNOS對促進干細胞從骨髓動員是必不可少的因素，并且是調(diào)節(jié)干（

3、祖）細胞活性和血管形成的重要因子[6]。吡格列酮是一種噻唑烷二酮類胰島素增敏劑，用于治療2型糖尿病有較好的降糖效果和耐受性。最新研究表明，吡格列酮可以促進EPCs介導(dǎo)的新生血管形成[7]，但其具體作用機制尚不明確。
　　本研究擬探討體外培養(yǎng)條件下，體內(nèi)不同濃度吡格列酮預(yù)處理、體外給予胰島素對正常大鼠骨髓源性EPCs的數(shù)量、增殖、凋亡以及分泌NO功能的影響，以期從新的角度認識吡格列酮和胰島素對心血管系統(tǒng)的保護作用。
　　方法:

4、
　　第一部分：EPCs的分離培養(yǎng)及表型鑒定：1.取大鼠四肢骨骨髓，以密度梯度離心法分離出單核細胞，于添加了VEGF和bFGF的M199培養(yǎng)液中培養(yǎng)并定期觀察；2.DiI-ac-LDL和FITC-UEA-I免疫熒光雙染法鑒定細胞。
　　第二部分：不同濃度吡格列酮對大鼠骨髓內(nèi)皮祖細胞增殖、凋亡及功能的影響：1.雄性SD大鼠隨機分為四組：對照組和吡格列酮組（10、20、40mg·kg-1·d-1）并給予相應(yīng)灌胃處理10天；2.密

5、度梯度離心法分離骨髓單核細胞并消化得EPCs；3.各組EPCs計數(shù)并繼續(xù)培養(yǎng)；4.MTT法檢測EPCs增殖能力；5.流式細胞雙染法檢測EPCs凋亡；6.硝酸還原酶法測NO分泌量。
　　第三部分：吡格列酮和胰島素對骨髓內(nèi)皮祖細胞增殖、凋亡及NO分泌的影響：1.雄性SD大鼠隨機分為吡格列酮組和非吡格列酮組并給予相應(yīng)灌胃預(yù)處理10天；2.密度梯度離心法分離單核細胞并培養(yǎng)5天后消化得EPCs；3.將所得EPCs相應(yīng)分為對照組、胰島素組、吡

6、格列酮組、吡格列酮＋胰島素（即聯(lián)合用藥組）并給予胰島素干預(yù)；4.MTT法檢測EPCs增殖能力；5.流式細胞雙染法檢測EPCs凋亡；6.硝酸還原酶法測NO分泌量。
　　結(jié)果:
　　1.培養(yǎng)7天的細胞經(jīng)DiI-ac-LDL和FITC-UEA-I雙染后，激光共聚焦顯微鏡下示雙染陽性的細胞為正在分化的內(nèi)皮祖細胞。
　　2.不同濃度吡格列酮均能提高EPCs數(shù)量和功能。
　　3.中等濃度吡格列酮（20mg·kg-1·d-1）

7、處理組對EPCs的促增殖、促NO分泌作用較10，40mg·kg-1·d-1組作用強，但其抑制EPCs凋亡作用與后二者差別無明顯統(tǒng)計學意義。
　　4.吡格列酮和胰島素單獨作用及聯(lián)合作用均可促進EPCs增殖、抑制其凋亡，并促進其分泌NO。
　　5.胰島素促進EPCs增殖作用較吡格列酮強，但其抑制EPCs凋亡及促進EPCs分泌NO作用與吡格列酮無明顯差別。
　　6.吡格列酮和胰島素二者聯(lián)合作用促進EPCs增殖、抑制其凋亡，并