吡格列酮對高脂血癥大鼠主動脈NOS-NO和AdipoR的影響.pdf

1、高脂血癥(Hyperlipemia,HL)是動脈粥樣硬化形成的一個重要危險因素,動脈粥樣硬化早期升高的氧化低密度脂蛋白和膽固醇可對動脈內膜功能性損傷,影響內皮功能。內皮在維持血管完整性有著重要的作用,內皮損傷在動脈粥樣硬化病程中有著始發(fā)作用,與動脈粥樣硬化、急性冠脈綜合癥、高血壓等多種心血管疾病發(fā)展和病理有著密切聯(lián)系。動脈粥樣硬化過程進行性發(fā)展會導致嚴重心腦血管突發(fā)事件,患者預后差,嚴重影響生存及生活質量。早期干預血脂所致的動脈損傷,并

2、修復血管,阻斷動脈粥樣硬化病情進展,在控制心血管急性事件發(fā)生中有著重要的作用。
　　 動脈粥樣硬化早期變化為內皮損害,一氧化氮合酶(NOS)表達及相關輔助因子系統(tǒng)改變,導致一氧化氮(NO)破壞增加,NO的合成減少,內皮依賴性舒張功能調節(jié)失衡,可導致動脈粥樣硬化形成。通過合理升高NO水平能夠改善內皮功能,從而阻止動脈粥樣硬化病情進展。脂聯(lián)素(ADP)是一個與體脂含量呈負相關的脂肪細胞因子,已證實其具有廣泛的生物學活性,如抗炎,增加

3、胰島素敏感性等,低脂聯(lián)素血癥日漸成為心血管疾病的獨立危險因素。脂聯(lián)素受體(AdipoR)1/2調節(jié)脂聯(lián)素調節(jié)的胰島素敏感性,AdipoR1/2表達于骨骼肌和肝臟,其可能在調節(jié)ADP抗炎作用,改善內皮細胞功能障礙。過氧化物酶體增生物激活受體γ(PPARγ)作為轉錄因子屬于核受體超家族。吡格列酮為PPARγ激動劑,不僅能調節(jié)脂質代謝,而且能通過抑制血管的炎癥反應、提高纖維溶解系統(tǒng)活性、改善內皮細胞功能,降低C反應蛋白質水平。但其改善主動脈血

4、管功能機制尚不明確。因此筆者采用高脂飲食建立高脂血癥大鼠主動脈損傷模型,探討吡格列酮對高脂血癥大鼠主動脈損傷進程的干預作用及機制,為吡格列酮抗動脈粥樣硬化提供理論支持。
　　 目的:通過觀察吡格列酮對高脂血癥大鼠血漿脂聯(lián)素(ADP)、主動脈一氧化氮(NO)、抑制型一氧化氮合酶(iNOS)、結構型一氧化氮合酶(cNOS)、總一氧化氮合酶(tNOS)的改變和脂聯(lián)素受體(AdipoR)的表達改變及吡格列酮的干預影響,探討吡格列酮可能的

5、作用機制,為吡格列酮抗提供理論依據。
　　 方法:前12周,27只雄性SD大鼠經隨機數字表隨機分為兩組,隨機分為正常對照組9只、高脂飲食組18只,進行造模實驗。12周后,存活的造模組17只大鼠按隨機數字表隨機分為模型組、吡格列酮組。對照組喂以標準大鼠飼料,造模組依據給予高脂飲食(膽固醇2％、膽酸鹽0.5％、甲基硫氧嘧啶0.2％和72.3％基礎飼料)喂養(yǎng),喂養(yǎng)12周后,第12周末從眼眶后靜脈抽血檢測血脂水平以確定模型是否復制成功,

6、并檢測血糖(blood glucose,BG)水平。隨后將高脂飲食組大鼠隨機分為模型組和吡格列酮組,吡格列酮組:吡格列酮10mg·kg-1·d-1連續(xù)灌胃,對照組和模型組:雙蒸水灌胃,1.5 ml/100g體重,1次/日；均灌胃4 w。給藥4周后,禁食24小時,于次日上午8時,用20％氯胺酮,以l ml/100g劑量麻醉后,剪開胸腹腔,暴露心臟,左心室穿刺取血5 ml,室溫靜置1小時后,3000轉/分離心5分鐘,分離血清置-20℃冰箱保

7、存,待測血清指標；于冰盤中分離主動脈,并在主動脈弓與胸主動脈交界處取材,用10％中性甲醛固定作HE病理檢測,剩余主動脈組織置液氮中保存待測其他指標。
　　 吡格列酮干預4周后,檢測各組血脂水平,三酰甘油(TG)用TPO-PAP法檢測,總膽固醇(TC)用CHOD-PAP法檢測,低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)和高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)用選擇性沉淀法檢測,并檢測BG。用伊紅染色法、免疫組化染色顯示血管內皮細胞后采用光鏡觀察、

8、電鏡觀察內皮細胞微觀結構。酶聯(lián)免疫法檢測血清ADP、硝酸還原法測血清和主動脈NO、精氨酸催化法檢測主動脈tNOS、iNOS及cNOS(等于tNOS與iNOS之差)的水平。蛋白免疫印跡雜交法測主動脈脂聯(lián)素受體1和2蛋白水平、實時熒光定量PCR法測主動脈脂聯(lián)素受體1和2基因表達。光鏡和電鏡觀察主動脈形態(tài)學改變。主動脈NOS-NO,脂聯(lián)素及其受體下降可能介入高脂血癥血管損傷,吡格列酮具有抗動脈粥樣硬化作用,該作用可能與提高血清ADP和主動脈血

9、管AdipoR表達有關。
　　 統(tǒng)計方法:統(tǒng)計軟件使用SPSS13.0進行分析,定量數據以均數±標準差((x)±s)表示；兩組資料比較若方差齊,用獨立樣本的t檢驗,若方差不齊,用Welch校正t檢驗；多組間比較用完全隨機化設計資料的方差分析,若方差齊,則采用LSD檢驗進行兩兩比較,若方差不齊用Dunnett's T3檢驗。P≤0.05認為有統(tǒng)計學意義。
　　 結果
　　 1.大鼠血脂、血糖變化吡格列酮干預前,造模

10、后第12周高脂飲食組TG、TC、LDL-C較對照組明顯升高(P<0.01),HDL-C、BG高脂飲食組較對照組差異無統(tǒng)計學意義(P=0.091,P=0.884)。經吡格列酮干預4周后,模型組較正常對照組TG、TC明顯升高(p<0.01),吡格列酮組較模型組TG、TC顯著下降(P<0.01)；TG、TC吡格列酮組較對照組差異無統(tǒng)計學意義(P=0.562,P=0.931)。對照組、模型組、吡格列酮組間HDL-C、LDL-C、BG差異無統(tǒng)計學

11、意義(P=0.884,P=0.177.P=0.860),但吡格列酮組HDL-C有升高趨勢。
　　 2.大鼠主動脈形態(tài)學改變
　　 2.1.主動脈病理HE染色形態(tài)改變對照組主動脈內皮未見明顯改變,內皮保持連續(xù)性、內膜完整、未見平滑肌增厚；模型組出現脂質沉積,部分內膜增厚,平滑肌紊亂、增生,內皮斷裂,缺如；吡格列酮組內膜及平滑肌未見明顯改變。
　　 2.2.光鏡顯示形態(tài)學改變第八因子相關CD31抗體顯示血管內皮細胞后

12、采用光鏡觀察,對照組大鼠主動脈內皮光滑平整,平滑肌組織分布均勻。模型組大鼠主動脈內皮組織大部脫落,平滑肌明顯增生,排列紊亂,細胞肥大,垂直于內膜。吡格列酮組主動脈內皮基本完好,偶有脫落,平滑肌細胞增殖不明顯,排列規(guī)則,形態(tài)基本正常。
　　 2.3.電鏡血管內皮細胞超微結構改變對照組大鼠血管內皮細胞正常,胞漿內線粒體正常,胞核結構正常,內彈力膜連續(xù),厚薄均勻,平滑肌細胞正常。模型組大鼠內皮細胞病變較重,胞膜破裂,胞質脫失、外溢或疏

13、松變性,胞質內細胞器溶解或消失,胞核染色質疏松,電子密度減低,核膜不完整；內皮下纖維母細胞增生變,膠原纖維增多。內彈力膜中斷,厚薄不一,有灶性溶解,中膜平滑肌細胞脂質沉淀,呈泡沫樣改變。吡格列酮組大鼠血管內皮層整齊,內皮細胞幾乎正常,偶見內皮細胞的線粒體水腫,中膜的平滑肌細胞偶有線粒體水腫及泡沫樣變。
　　 3.主動脈NO和NOS活力的改變模型組主動脈NO水平低于對照組(P<0.01)；而吡格列酮組與對照組間差異無統(tǒng)計學意義(P

14、=0.490)；吡格列酮組與模型組間差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；模型組較對照組cNOS下降(P<0.01),吡格列酮組與對照組間差異無統(tǒng)計學意義(P=0.444)吡格列酮組較模型組升高,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。通過經完全隨機化方差分析得出各組間iNOS、tNOS活力改變差異無統(tǒng)計學意義(P=0.389,P=0.189)。
　　 4.血漿ADP水平改變模型組血漿ADP較對照組脂聯(lián)素水平明顯下降(P<0.01),吡格

15、列酮組血漿ADP水平明顯升高(P<0.05)。吡格列酮組與對照組相比差異無統(tǒng)計學意義(P=0.518)。
　　 5.主動脈AdipoRmRNA和AdipoR蛋白表達模型組AdipoR1mRNA水平低對照組(P<0.01),吡格列酮組與模型組間差異有統(tǒng)計學意義,高于模型組(P<0.01),對照組與吡格列酮組間未見明顯統(tǒng)計學意義(P=0.062)。模型組AdipoR2mRNA水平低于對照組(P<0.01),吡格列酮組與對照組比較未見

16、統(tǒng)計學差異(P=0.191),吡格列酮組與模型組間有統(tǒng)計學差異,高于模型組(P<0.01)。模型組AdipoR1蛋白水平低對照組(P<0.01),吡格列酮組與模型組間差異有統(tǒng)計學意義,高于模型組(P<0.05)。吡格列酮組與對照組之間差異無統(tǒng)計學意義(P=0.182)。模型組AdipoR2蛋白水平低于對照組(P<0.01),吡格列酮組與對照組比較未見統(tǒng)計學差異(P=0.068),吡格列酮組與模型組間有統(tǒng)計學意義,高于模型組(P<0.01

17、)。
　　 結論
　　 1.高脂飲食造成高脂血癥出現,大鼠TG、TC、LDL-C顯著增高,成功復制了高脂血癥大鼠模型；病理顯示血管內皮斷裂,缺如,內膜增厚,平滑肌紊亂、增生。
　　 2.觀察到模型組大鼠主動脈NO、cNOS水平下降,血漿ADP的濃度顯著下降,同時熒光實時定量PCR及Western Blotting結果顯示主動脈AdipoRmRNA及其蛋白合成減少；
　　 3.吡格列酮能明顯改善高脂血癥大鼠