吡格列酮對代謝綜合征大鼠骨髓內(nèi)皮祖細胞功能的影響及其機制研究.pdf

1、背景:
　　代謝綜合征(Metabolic Syndrome，MS)是心血管的多種代謝危險因素（糖代謝異常、高血壓、血脂紊亂、中心型肥胖等）聚集一體的臨床癥候群。目前，MS是在全球非常流行的疾病之一，發(fā)病率隨年齡的增長增高。
　　MS患者患心血管疾病的風(fēng)險增加2-4倍，使患糖尿病的風(fēng)險增加5倍。血管內(nèi)皮細胞功能障礙是動脈粥樣硬化形成中一個關(guān)鍵的早期病變。血管內(nèi)皮結(jié)構(gòu)和功能的完整性在血管的體內(nèi)平衡中發(fā)揮重要作用。
　　1

2、997年，Asahara等證實循環(huán)細胞具有分化為成熟內(nèi)皮細胞并參與新血管形成的潛能，這種細胞被命名為內(nèi)皮祖細胞(Endothelial progenitorcells，EPCs)，可以促進內(nèi)皮再生和心血管形成。在心血管疾病防治中，EPCs有廣闊的應(yīng)用前景。有研究表明，MS患者EPCs的生物學(xué)功能受損。研究如何改善MS患者EPCs受損的生物學(xué)功能，將對MS患者心血管病變的防治有重大意義。然而，目前這方面的研究鮮有報道。
　　吡格列酮

3、是選擇性過氧化物酶增殖受體γ(Peroxisome proliferator-activated receptor-γ，PPAR-γ)激動劑，可降低2型糖尿病患者的血糖水平。推測吡格列酮對MS的EPCs各種生物學(xué)功能也會有一定程度的影響，究竟影響如何？通過的作用途徑如何？在體實驗和離體實驗結(jié)果基本符合嗎？對這些問題的深入研究未見報道。
　　本研究擬通過建立的MS大鼠模型研究MS大鼠EPCs生物學(xué)功能及PPAR-γ激動劑吡格列酮對其

4、的影響，探討其可能的作用機制，為預(yù)防和治療MS患者血管病變做好前期準(zhǔn)備。課題分三部分，主要方法和結(jié)果如下:
　　第一部分:建立飲食誘導(dǎo)的MS大鼠模型及觀察吡格列酮對其生理指標(biāo)的影響
　　目的:
　　1.建立飲食誘導(dǎo)的MS大鼠模型。
　　2.觀察吡格列酮對MS大鼠模型胰島素抵抗、體重、血壓及生化指標(biāo)的影響。
　　方法:
　　1.健康的6周齡雄性SD大鼠60只，隨機分為兩組:正常對照組(NC組，n=15)

5、及模型組(n=45)。
　　2.高糖、高脂以及高鹽飲食喂養(yǎng)大鼠12周，建立飲食性MS大鼠模型。
　　3.模型組大鼠共有35只成模，隨機分為兩組:MS組（n=17），繼續(xù)給予高糖、高脂及高鹽飲食同時每天以生理鹽水2ml灌胃，共8周;吡格列酮組(n=18)，繼續(xù)給予高糖、高脂及高鹽飲食同時每天以吡格列酮3mg/(kg.d)灌胃，共8周。NC組(原正常對照組，n=15)，每天以生理鹽水2ml灌胃，共8周。
　　4.在不同時間

6、點對各組大鼠進行血糖、血壓、血脂、胰島素抵抗指數(shù)等測定。
　　結(jié)果:
　　實驗開始時，NC組與模型組大鼠體重（BW）、空腹血糖(FBG)、胰島素(FINS)、胰島素抵抗指數(shù)(IRI)、尾動脈收縮壓(SBP)、甘油三酯(TG)、膽固醇（TC）、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)及低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)等差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。
　　飲食喂養(yǎng)12周后，與NC組比較，模型組大鼠的SBP、BW、FBG、FI

7、NS、IRI和血清TC明顯升高(P＜0.01)，HDL-C降低(P＜0.01)。
　　藥物干預(yù)8周后，與MS組比較，吡格列酮干預(yù)組SBP、TC、LDL-C、FBG、FINS、IRI明顯下降（P＜0.01）;而HDL-C水平升高（P＜0.01）。藥物干預(yù)8周后，與藥物干預(yù)前比較，吡格列酮干預(yù)組SBP、FBG、FINS、IRI明顯下降（P＜0.01）。
　　結(jié)論:
　　1.經(jīng)過12周高糖、高鹽及高脂飲食喂養(yǎng)SD大鼠，成功建

8、立了與人MS相似的大鼠模型。
　　2.經(jīng)過8周吡格列酮干預(yù)，能改善MS大鼠的胰島素抵抗、血壓及血脂異常。
　　第二部分:大鼠骨髓EPCs的體外培養(yǎng)及鑒定
　　目的:
　　研究大鼠骨髓EPCs的體外培養(yǎng)及鑒定方法。
　　方法:
　　1.大鼠骨髓EPCs的體外培養(yǎng)
　　使用密度梯度離心法及差速貼壁法聯(lián)合的方法培養(yǎng)EPCs，在倒置顯微鏡下觀察細胞生長情況及形態(tài)變化。
　　2.大鼠骨髓EPCs的鑒

9、定
　　測定EPCs生長曲線，使用Dil標(biāo)記的乙?；兔芏戎鞍缀虵ITC標(biāo)記的荊豆凝集素1雙熒光染色、流式細胞儀檢測細胞表面抗原CD34、CD133表達情況及matrigel成血管實驗鑒定細胞。
　　結(jié)果:
　　培養(yǎng)前4d的EPCs增殖不明顯，第5-10天迅速增殖，并可見細胞集落及線狀結(jié)構(gòu)形成，第10天可達80％融合。培養(yǎng)第7天的EPCs具有吞噬Dil標(biāo)記的乙?；兔芏戎鞍缀虵ITC標(biāo)記的荊豆凝集素l的功能，在激光

10、共聚焦顯微鏡下顯示黃色熒光。流式細胞儀檢測體外培養(yǎng)第10天的細胞，CD133+細胞占19.2％，CD34+細胞占28.7％，CD34+/CD133+細胞占19.1％。培養(yǎng)12d的EPCs，在matrigel上可形成微血管狀結(jié)構(gòu)
　　結(jié)論:
　　密度梯度離心法聯(lián)合差速貼壁法可在體外有效分離培養(yǎng)大鼠骨髓EPCs。
　　第三部分:探討吡格列酮對MS組大鼠骨髓EPCs部分生物學(xué)功能的影響及其機制
　　目的:
　　1

11、.觀察吡格列酮對MS大鼠模型骨髓來源的EPCs生物學(xué)功能（增殖能力、遷移能力、黏附能力、血管形成能力和抗凋亡）的影響。
　　2.探討吡格列酮對MS大鼠模型骨髓來源的EPCs生物學(xué)功能（增殖能力、遷移能力、黏附能力、血管形成能力和抗凋亡）影響的部分機制。
　　方法:
　　實驗開始第20周，處死NC組、MS組和吡格列酮干預(yù)組實驗動物，密度梯度離心法分離大鼠骨髓EPCs（方法同前），進行以下研究。
　　1.NC組、MS

12、組和吡格列酮干預(yù)組大鼠骨髓EPCs生物學(xué)功能的比較
　　三組大鼠骨髓EPCs，培養(yǎng)一定時間后，采用改良Boyden小室、MTT比色法、人工計數(shù)、流式細胞儀觀察比較各組EPCs黏附、遷移、增殖、血管新生能力及凋亡情況。
　　2.不同濃度的吡格列酮對MS大鼠骨髓EPCs生物學(xué)功能的影響
　　MS大鼠骨髓EPCs經(jīng)無酚紅、無血清DMEM同步化后，加入吡格列酮使其終濃度為0、10μmol/L、50μmol/L、100μmol/

13、L、200μmol/L，觀察比較各組EPCs黏附、遷移、增殖、血管新生能力及凋亡情況。
　　3.PI3K/Akt信號通路在吡格列酮介導(dǎo)的MS大鼠骨髓EPCs生物學(xué)功能變化中的作用
　　將MS大鼠骨髓EPCs隨機分五組:A組:只加培養(yǎng)液為對照組;B組:加入終濃度50μmol/LPPAR-γ配體吡格列酮;C組:加入終濃度50μmol/LPPAR-γ配體吡格列酮及10μmol/lPPAR-γ拮抗劑GW9662;D組:加入終濃度50

14、μmol/L的PPAR-γ配體吡格列酮及50μmol/LPI3K/Akt通道阻滯劑Wortmannin;E組:加入終濃度50μmol/L的PPAR-γ配體吡格列酮及20μmol/LERK通道阻滯劑PD98059。觀察比較各組EPCs黏附、遷移、增殖、血管新生能力及凋亡情況。
　　4.吡格列酮對MS大鼠骨髓EPCsAkt蛋白磷酸化中的作用
　　1)終濃度為0、10μmol/L、50μmol/L、100μmol/L、200μmo

15、l/L吡格列酮干預(yù)MS組EPCs24h，Westernblot檢測其介導(dǎo)的MS組EPCsAkt蛋白磷酸化。p-Akt/Akt比值表示Akt活化情況。
　　2)終濃度為50μmol/L吡格列酮作用EPCs不同時間(0min、5min、15min、30min、45min、60min)誘導(dǎo)EPCsAkt蛋白快速磷酸化，比較各時間點的效果。
　　3)Western blot檢測觀察PPAR-γ拮抗劑GW9662及PI3K/Akt通道

16、阻滯劑Wortmannin對吡格列酮介導(dǎo)的MS組EPCsAkt蛋白磷酸化的影響。將EPCs隨機分五組(A-E組，同上)，Westernblot檢測觀察各組EPCsAkt蛋白磷酸化。
　　結(jié)果:
　　與NC組比較，MS組大鼠骨髓EPCs的部分生物學(xué)功能（遷移、黏附、增殖及血管形成）受損，凋亡率高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　與MS組比，吡格列酮干預(yù)組大鼠的EPCs黏附、遷移、增殖及血管新生能力強，凋亡率低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意

17、義。
　　與其他濃度吡格列酮比，50μmol/L吡格列酮干預(yù)組對MS組大鼠EPCs黏附、遷移、增殖、血管新生的促進作用及抑制其凋亡的影響較顯著。
　　吡格列酮對EPCs黏附、遷移、增殖、血管新生能力及凋亡的影響在PI3K/Akt通道阻滯劑Wortmannin及PPAR-γ拮抗劑GW9662存在時作用消失，而在ERK通道阻滯劑PD98059存在時仍存在。
　　Westemblot分析顯示:10-200μmol/L吡格列酮

18、干預(yù)均能誘導(dǎo)EPCsAkt蛋白快速磷酸化，50μmol/L作用最明顯;50μmol/L吡格列酮作用30min時誘導(dǎo)EPCsAkt蛋白快速磷酸化最明顯;PPAR-γ拮抗劑GW9662及PI3K/Akt通道阻滯劑Wortmannin均可抑制吡格列酮介導(dǎo)的EPCs/Akt蛋白磷酸化。ERK通道阻滯劑PD98059不能抑制吡格列酮介導(dǎo)的EPCs/Akt蛋白磷酸化。
　　結(jié)論:
　　與NC組比較，MS組大鼠骨髓EPCs的部分生物學(xué)功能