葡萄糖和胰島素對大鼠骨髓內(nèi)皮祖細(xì)胞增殖和功能的影響.pdf

1、研究背景和目的 內(nèi)皮祖細(xì)胞（EPC）是來源于骨髓，表達(dá)AC133，VEGFR-2 (flk-1)等表面標(biāo)志的一類細(xì)胞[1]，可以歸巢到內(nèi)皮損傷及缺血部位并分化為內(nèi)皮細(xì)胞，因而在血管內(nèi)皮損傷修復(fù)及梗死區(qū)血運(yùn)重建中發(fā)揮重要作用。有研究提示外周血中EPC的數(shù)量減少是心血管事件的危險因子[2]。外周血EPC的數(shù)量和功能受多種內(nèi)源及外源性因素如高血脂、高血糖等的調(diào)控[3-5]，而胰島素對EPC的影響尚不明確。 本研究擬探討體外培養(yǎng)

2、條件下，不同濃度胰島素在正常和高糖環(huán)境中對骨髓來源EPC 的增殖、衰老、黏附、NO 分泌的影響，同時明確高糖對骨髓EPC 的長期影響，以期從新的角度理解胰島素和高糖對心血管系統(tǒng)的作用。 方法: 第一部分：EPC 的分離培養(yǎng)及表型鑒定: 1．取大鼠股骨骨髓，以密度梯度離心法分離出單核細(xì)胞，在添加了VEGF 和bFGF 的M199 培養(yǎng)基中培養(yǎng)，并定期觀察； 2．Flk-1 和AC133 免疫熒光雙染，鑒定細(xì)

3、胞表型； 第二部分：葡萄糖及胰島素對EPC 的影響: 1．取培養(yǎng)5 天的細(xì)胞，分別給予不同濃度葡萄糖、不同濃度胰島素及高糖條件下給予不同濃度胰島素干預(yù)2 天和7 天； 2．MTT 檢測細(xì)胞增殖能力； 3．衰老相關(guān)-β-半乳糖苷酶染色檢測細(xì)胞衰老水平； 4．短時貼壁結(jié)晶紫染色法檢測細(xì)胞黏附能力； 5．干預(yù)24h 后硝酸酶還原法檢測NO 分泌水平。 統(tǒng)計學(xué)分析：數(shù)值均以?x±s 表示。

4、數(shù)據(jù)采用SPSS13.0 統(tǒng)計軟件包進(jìn)行統(tǒng)計分析，應(yīng)用單因素方差分析進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，有統(tǒng)計學(xué)意義的采用LSD-t檢驗進(jìn)一步比較。 結(jié)果: 1．細(xì)胞鑒定示細(xì)胞呈AC133 與flk-1 雙陽性，證實所得到的細(xì)胞為內(nèi)皮祖細(xì)胞。 2．與對照組相比，胰島素干預(yù)7 天對EPC 增殖和黏附有明顯的促進(jìn)作用；低濃度胰島素（0.1，1 nmol/L）干預(yù)7 天可顯著地使EPC 衰老比率下降，而10 nmol/L 胰島素組與對照組

5、相比衰老細(xì)胞比率無統(tǒng)計學(xué)差異；低濃度胰島素（0.1，1 nmol/L）干預(yù)24 h 可促進(jìn)EPC 分泌NO，但胰島素濃度進(jìn)一步加大時無明顯促進(jìn)作用。 3．高濃度葡萄糖（20 mmol/L）干預(yù)2 天可以促進(jìn)EPC 的增殖，而干預(yù)7 天可抑制EPC 的增殖，加快EPC 衰老，降低EPC 黏附能力，干預(yù)24 h 可抑制EPC 分泌NO。滲透壓對照組（5 mmol/L 葡萄糖＋35 mmol/L 甘露醇） 與5 mmol/L

6、葡萄糖組相比在增殖、衰老、黏附及NO 分泌方面均無明顯差異。 4．與單純高糖組（40 mmol/L 葡萄糖）相比，胰島素在高糖條件下干預(yù)7 天可明顯促進(jìn)EPC 增殖，在胰島素濃度為1 nmol/L 時達(dá)到峰值；低胰島素（0.1, 1 nmol/L）干預(yù)7 天可明顯降低高糖所致的EPC 衰老，但10 nmol/L 胰島素組與單純高糖組衰老率無明顯差異；低濃度胰島素在高糖條件下干預(yù)7天對EPC 的黏附能力無明顯影響，在10 nmol

7、/L 時反而有抑制作用；胰島素在高糖條件下干預(yù)24h 可促進(jìn)NO 分泌，在胰島素濃度為10 nmol/L 時達(dá)到峰值。 結(jié)論: 1．高糖短期干預(yù)對體外培養(yǎng)條件下的EPC 具有促增殖作用。 2．高糖長期干預(yù)損害EPC 增殖，加快EPC 衰老，抑制EPC 黏附，抑制NO 分泌。 3．高糖對EPC 的以上作用不是由滲透壓改變造成的。 4．在正常濃度葡萄糖和高糖條件下，胰島素都能促進(jìn)EPC 增殖和NO分泌