內(nèi)皮素-1對大鼠骨髓內(nèi)皮前體細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期、NO分泌及凋亡的影響.pdf

1、研究背景及目的：
　　內(nèi)皮素家族包括內(nèi)皮素-1(ET-1)、內(nèi)皮素-2(ET-2)和內(nèi)皮素-3(ET-3)，均是含有21個(gè)氨基酸殘基的短肽。ET-1主要由血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌，在脈管系統(tǒng)作用最強(qiáng)，是已知最有力的血管收縮劑。ET-1是一種多功能調(diào)節(jié)肽，具有廣泛的生物學(xué)效應(yīng)，具有介導(dǎo)炎癥、刺激其它激素分泌、促有絲分裂、刺激細(xì)胞增殖、移行和黏附等多種功能，通過自分泌和旁分泌方式經(jīng)受體發(fā)揮作用。許多臨床和實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)ET-1作為一種血管活性肽

2、，在血管生成過程中也發(fā)揮作用。ET-1通過直接作用于內(nèi)皮細(xì)胞上的ETB受體，在新生血管的不同階段發(fā)揮調(diào)節(jié)作用，包括細(xì)胞增殖、遷移和蛋白酶的合成等，在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中ET-1也能刺激新血管生成。
　　內(nèi)皮前體細(xì)胞（EPC）又稱內(nèi)皮祖細(xì)胞，是一類能循環(huán)、增殖并分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞，但尚未表達(dá)成熟血管內(nèi)皮細(xì)胞表型特征的前體細(xì)胞。研究發(fā)現(xiàn)，EPC不僅參與人胚胎血管生成，同時(shí)也參與出生后血管新生和內(nèi)皮損傷后的修復(fù)過程。當(dāng)發(fā)生血管損傷時(shí)，內(nèi)皮前體細(xì)胞

3、從骨髓釋放入外周血，遷移至受損部位，摻入血管壁中，分化為成熟內(nèi)皮細(xì)胞，修復(fù)受損血管，參與血管新生，改善甚至恢復(fù)缺血組織的血供。
　　本研究擬探討體外培養(yǎng)條件下，不同濃度ET-1對骨髓來源EPC的增殖、細(xì)胞周期、NO分泌和凋亡的影響，以期從新的角度理解ET-1對心血管系統(tǒng)的作用。
　　實(shí)驗(yàn)方法：
　　第一部分EPC的培養(yǎng)和鑒定：
　　1、取大鼠股骨骨髓，以密度梯度離心法分離出單核細(xì)胞，在添加了VEGF和bFGF的M

4、199培養(yǎng)基中培養(yǎng)，并定期觀察；
　　2、DiⅠ-ac-LDL和FITC-UEA-Ⅰ免疫熒光雙染，鑒定細(xì)胞表型。
　　第二部分ET-1對EPC增殖、細(xì)胞周期、NO分泌和凋亡的影響：
　　1、取培養(yǎng)5天的細(xì)胞，分別給予不同濃度ET-1干預(yù)不同時(shí)間；
　　2、MTT檢測細(xì)胞增殖能力；
　　3、流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期；
　　4、硝酸還原酶法檢測NO分泌水平；
　　5、流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率。

5、　　統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：數(shù)值均以x±s表示。數(shù)據(jù)采用SPSS11.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，應(yīng)用單因素方差分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的采用LSD-t檢驗(yàn)進(jìn)一步比較。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
　　1、細(xì)胞鑒定示細(xì)胞呈DiⅠ-ac-LDL和FITC-UEA-Ⅰ雙陽性，證實(shí)所得到的細(xì)胞為EPC。
　　2、EPC增殖能力在ET-1干預(yù)后48h開始明顯增強(qiáng)(P<0.05)，干預(yù)72h和96h后明顯高于對照組(P<0.01)；在濃度為10-6

6、mol/L時(shí)最為顯著(P<0.01)。
　　3、ET-1能夠促進(jìn)EPC向S期和G2/M期的轉(zhuǎn)化，在濃度為10-6mol/L時(shí)達(dá)到最大效應(yīng)(P<0.01)。
　　4、EPC分泌NO能力在ET-1刺激后48h開始明顯增強(qiáng)(P<0.05)，干預(yù)72h和96h后明顯高于對照組(P<0.01)；在濃度為10-6mol/L時(shí)最為顯著(P<0.01)。
　　5、ET-1能夠誘導(dǎo)EPC凋亡，干預(yù)48h時(shí)最顯著(P<0.01)，72h、