槲皮素對人內(nèi)皮祖細胞增殖和凋亡的影響及機制研究.pdf

1、目的:研究氧自由基對內(nèi)皮祖細胞(EPCs)的損傷及槲皮素(quercetin,Que)的保護作用,并探討可能機制。
　　 方法:(1)外周單個核細胞的分離:抽取健康足月孕產(chǎn)婦胎盤臍帶血60ml,按20U/ml加入普通肝素抗凝,采用明膠沉淀法聯(lián)合密度梯度離心法分離獲得單個核細胞,并進行細胞活力計算(死細胞藍色、活細胞不著色),活細胞占98％以上可進行接種,上述過程在四個小時內(nèi)完成。(2)誘導分化:將細胞以4×106/cm2密度接種

2、于纖維連接蛋白包被的25cm2培養(yǎng)瓶中(4μg/cm2),加入5ml M199培養(yǎng)基,添加10％胎牛血清、1％青鏈霉素(1萬單位/m1)、VEGF50ng/ml、b-FGF1ng/ml,置于5％CO2、飽和濕度、37℃孵育箱中,成纖維細胞多于24小時以內(nèi)貼壁,24小時后取未貼壁細胞繼續(xù)培養(yǎng)至第四天,用磷酸鹽緩沖液洗掉未貼壁細胞,加培養(yǎng)液培養(yǎng)至第七天,進一步用磷酸鹽緩沖液洗掉未貼壁細胞,貼壁細胞供試驗用。(3)EPCs鑒定:利用免疫熒光法

3、檢測細胞表面標志 CD133；用EPCs特異性抗體FITC-UEA-I和DiI-acLDL對貼壁細胞進行免疫熒光染色。(4)分組及干預:EPCs細胞培養(yǎng)七天后,0.25％胰酶消化收集貼壁細胞,制成細胞懸液計數(shù),隨機分為空白對照組(不加干預)；Que組(分別加入60μmol/L、90μmol/L、120μmol/L濃度的 Que)；H2O2組(加入500μmol/L過氧化氫(H2O2))；Que+H2O2組(先加入Que60μmol/L、

4、90μmol/L、120μmol/L,后加500μmol/L H2O2共同培養(yǎng))。在96或6孔板中培養(yǎng)24小時后,用于各指標檢測。(5)EPCs增殖觀察:每組設(shè)6個復孔,以每孔2×103個細胞接種于96孔板中,采用 WST-1法檢測 Que在有或無H2O2作用下對EPCs24小時和48小時增殖的影響。(6)EPCs凋亡的觀察:采用異硫氰酸熒光標記的 Annexin—v、PI雙染色免疫熒光法檢測EPCs的凋亡,并采用流式細胞儀檢測 Que

5、對H2O2誘導內(nèi)皮祖細胞凋亡的影響。(7)凋亡機制的研究:免疫細胞化學法檢測空白對照組、H2O2組、Que+H2O2組的 p-JNK蛋白表達,加入 JNK激動劑 Anisomycin10μmol/L后用流式細胞儀觀察各組凋亡率的變化。
　　 結(jié)果:(1)與空白對照組比較,60～90pmol/L的Que可以促進EPCs的增殖,120μmol/L的 Que則表現(xiàn)出抑制EPCs增殖的作用,與培養(yǎng)24小時比,在48小時對EPCs的抑制作

6、用較為明顯,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。(2)與空白對照組比較,H2O2組 EPCs增殖能力明顯降低,差異有顯著統(tǒng)計學意義(P<0.01)。加入60～120μmol/L的Que處理后,H2O2誘導的EPCs損傷后的細胞增殖能力得到明顯改善,且具有明顯的時間和濃度依賴性,與H2O2組比較,差異有顯著統(tǒng)計學意義(P<0.01)。(3)Que在60μmol/L~120μmol/L范圍內(nèi)隨著濃度的增加,使 H2O2誘導的EPCs凋亡率逐漸

7、降低。在60μmol/L、90μmol/L、120μmol/L濃度的 Que作用下,凋亡率依次為(27.43±0.58)％、(23.12±0.37)％、(22.43±0.16)％,與H2O2組((36.58±0.45)％)比較,差異有顯著統(tǒng)計學意義(P<0.01)；與90μmol/L Que+H2O2組比較,120μmol/L Que+H2O2組的凋亡率無明顯差異(P>0.05)。(4)p-JNK陽性表達顯示細胞胞漿和胞核出現(xiàn)棕黃色顆粒

8、,隨著槲皮素濃度的增加,p-JNK陽性表達產(chǎn)物逐漸減少,染色變得淺淡。Que能夠抑制加入JNK激動劑后EPCs凋亡率的增加,Anisomycin+Que(60μmol/L、90μmol/L、120μmol/L)+H2O2組的凋亡率依次為(42.36±0.53)％、(38.32±0.30)％、(35.78±0.54)％,與Anisomycin+H2O2組((47.35±0.64)％)比較,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。