不同濃度葡萄糖、胰島素對Colon26腫瘤細胞分泌VEGF的影響.pdf

1、目的：糖尿病病人易患結直腸癌，國外流行病學調查發(fā)現(xiàn)，糖尿病人群患結直腸癌的風險較非糖尿病人群明顯增加。VEGF作為最重要的血管生成調節(jié)因子，在腫瘤血管新生以至對腫瘤的發(fā)生發(fā)展有重要作用。同時，VEGF又是一種免疫抑制分子，在介導腫瘤免疫抑制以至對腫瘤發(fā)生發(fā)展也有重要作用。糖尿病患者血清中VEGF的含量較非糖尿病患者增高，尤以伴發(fā)微血管并發(fā)癥者增高明顯，且與患者血漿葡萄糖和胰島素濃度關系密切。 血漿葡萄糖和胰島素濃度的變化，在糖尿

2、病的發(fā)病過程中有明顯的階段性。本研究模擬糖尿病病程中葡萄糖和胰島素濃度的變化，觀察不同濃度葡萄糖、不同濃度胰島素以及不同濃度葡萄糖和胰島素聯(lián)合作用對Colon26腫瘤細胞分泌VEGF的影響，為探討葡萄糖和胰島素濃度的變化與糖尿病患者結直腸癌發(fā)生、發(fā)展的關系提供實驗和理論依據(jù)。 方法：體外常規(guī)培養(yǎng)Colon26腫瘤細胞，根據(jù)所用培養(yǎng)液含葡萄糖、胰島素濃度的不同，實驗所用細胞共分12組，A組：細胞培養(yǎng)液含10％新生牛血清的RPMI1

3、640培養(yǎng)液(對照組)；B組含10％新生牛血清的RPMI1640+5mmol/L葡萄糖；C組含10％新生牛血清的RPMI1640+10mmol/L葡萄糖；D組含10％新生牛血清的RPMI1640+25mmol/L葡萄糖；E組含10％新生牛血清的RPMI1640+5uIU/mL胰島素；F組含10％新生牛血清的RPMI1640+25uIU/mL胰島素；G組含10％新生牛血清的RPMI1640+125uIU/mL胰島素：H組含10％新生牛血清

4、的RPMI1640+5mmol/L葡萄糖+5uIU/mL胰島素；K組含10％新生牛血清的RPMI1640+5mmol/L葡萄糖+125uIU/mL胰島素；L組含10％新生牛血清的RPMI1640+25mmol/L葡萄糖+125uIU/mL胰島素；M組含10％新生牛血清的RPMI1640+25mmol/L葡萄糖+5uIu/mL胰島素；N組含10％新生牛血清的RPMI1640+25mmol/L葡萄糖+1.25uIU/mL胰島素。每組設3個復

5、孔，培養(yǎng)48小時后收集培養(yǎng)液上清，用ELISA法測VEGF的濃度；同時收集細胞抽提總RNA，RT-PCR同時擴增目的片段VEGF和內參照β-actin，瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統(tǒng)上掃描分析，計算VEGF mRNA相對表達量。整個實驗過程重復三次。統(tǒng)計學分析采用單因素方差分析和t檢驗，p<0.05有統(tǒng)計學意義。 結果： 1.不同濃度的葡萄糖對Colon26腫瘤細胞培養(yǎng)上清VEGF分泌的影響。B、C、D組(培養(yǎng)液含有5mm

6、ol/L的葡萄糖，10mmol/L的葡萄糖，25mmol/L的葡萄糖)的VEGF濃度(9.4167±0.4646，9.4667±0.1528，9.6167±0.2887)與A組(對照組)的VEGF濃度(9.5583±0.2691)相比無顯著性差別。 2.不同濃度的胰島素對Colon26腫瘤細胞培養(yǎng)上清VEGF分泌的影響。G組(培養(yǎng)液含有125uIU/mL的胰島素)的VEGF濃度(27.7667±0.2517)明顯高于A組(對照組

7、)、E組、F組(培養(yǎng)液分別含有5uIU/mL，25uIU/mL的胰島素)的VEGF濃度(9.5583±0.2691，9.5833±0.0764，9.6167±0.1258)，差異有顯著性，而A組、E組與F組之間無差異。 3.不同濃度的葡萄糖、胰島素對Colon26腫瘤細胞培養(yǎng)上清VEGF分泌的影響。K、L組(培養(yǎng)液均含有125 uIU/mL胰島素)的VEGF濃度(27.8333±0.3512，27.6000±0.6557)均明顯

8、高于A組的VEGF濃度(9.5583±0.2691)，差異有顯著性，而K、L組組間無差異。H、M、N組(培養(yǎng)液分別含有5 uIU/mL，5uIU/mL，1.25ulU/mL的胰島素)的VEGF濃度(9.7167±0.00289，9.8667±0.0577，9.90±0.1732)與A組相比無顯著性差別。 4.VEGF mRNA的表達水平與上清中VEGF的分泌水平一致。經過瓊脂糖凝膠電泳擴增產物，紫外透射儀下觀察并拍照，同時用計算

9、機軟件進行圖像灰度掃描半定量分析。可以看到G、K、L組(培養(yǎng)液含有125uIU/mL的胰島素)的VEGF mRNA電泳條帶與A組(對照組)的VEGF mRNA的電泳條帶相比明顯增粗變亮，VEGF mRNA的表達水平(0.8802±0.19；0.8605±0.18；0.8569±0.22)與A組(對照組)VEGF mRNA的表達水平(0.4653±0.02)相比有統(tǒng)計學意義。而其他組與對照組相比電泳條帶在寬度和亮度上沒有差異，VEGF m