不同濃度葡萄糖、胰島素對Colon26腫瘤細胞分泌VEGF的影響.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、目的:糖尿病病人易患結直腸癌,國外流行病學調查發(fā)現(xiàn),糖尿病人群患結直腸癌的風險較非糖尿病人群明顯增加。VEGF作為最重要的血管生成調節(jié)因子,在腫瘤血管新生以至對腫瘤的發(fā)生發(fā)展有重要作用。同時,VEGF又是一種免疫抑制分子,在介導腫瘤免疫抑制以至對腫瘤發(fā)生發(fā)展也有重要作用。糖尿病患者血清中VEGF的含量較非糖尿病患者增高,尤以伴發(fā)微血管并發(fā)癥者增高明顯,且與患者血漿葡萄糖和胰島素濃度關系密切。 血漿葡萄糖和胰島素濃度的變化,在糖尿

2、病的發(fā)病過程中有明顯的階段性。本研究模擬糖尿病病程中葡萄糖和胰島素濃度的變化,觀察不同濃度葡萄糖、不同濃度胰島素以及不同濃度葡萄糖和胰島素聯(lián)合作用對Colon26腫瘤細胞分泌VEGF的影響,為探討葡萄糖和胰島素濃度的變化與糖尿病患者結直腸癌發(fā)生、發(fā)展的關系提供實驗和理論依據(jù)。 方法:體外常規(guī)培養(yǎng)Colon26腫瘤細胞,根據(jù)所用培養(yǎng)液含葡萄糖、胰島素濃度的不同,實驗所用細胞共分12組,A組:細胞培養(yǎng)液含10%新生牛血清的RPMI1

3、640培養(yǎng)液(對照組);B組含10%新生牛血清的RPMI1640+5mmol/L葡萄糖;C組含10%新生牛血清的RPMI1640+10mmol/L葡萄糖;D組含10%新生牛血清的RPMI1640+25mmol/L葡萄糖;E組含10%新生牛血清的RPMI1640+5uIU/mL胰島素;F組含10%新生牛血清的RPMI1640+25uIU/mL胰島素;G組含10%新生牛血清的RPMI1640+125uIU/mL胰島素:H組含10%新生牛血清

4、的RPMI1640+5mmol/L葡萄糖+5uIU/mL胰島素;K組含10%新生牛血清的RPMI1640+5mmol/L葡萄糖+125uIU/mL胰島素;L組含10%新生牛血清的RPMI1640+25mmol/L葡萄糖+125uIU/mL胰島素;M組含10%新生牛血清的RPMI1640+25mmol/L葡萄糖+5uIu/mL胰島素;N組含10%新生牛血清的RPMI1640+25mmol/L葡萄糖+1.25uIU/mL胰島素。每組設3個復

5、孔,培養(yǎng)48小時后收集培養(yǎng)液上清,用ELISA法測VEGF的濃度;同時收集細胞抽提總RNA,RT-PCR同時擴增目的片段VEGF和內參照β-actin,瓊脂糖凝膠電泳,凝膠成像系統(tǒng)上掃描分析,計算VEGF mRNA相對表達量。整個實驗過程重復三次。統(tǒng)計學分析采用單因素方差分析和t檢驗,p<0.05有統(tǒng)計學意義。 結果: 1.不同濃度的葡萄糖對Colon26腫瘤細胞培養(yǎng)上清VEGF分泌的影響。B、C、D組(培養(yǎng)液含有5mm

6、ol/L的葡萄糖,10mmol/L的葡萄糖,25mmol/L的葡萄糖)的VEGF濃度(9.4167±0.4646,9.4667±0.1528,9.6167±0.2887)與A組(對照組)的VEGF濃度(9.5583±0.2691)相比無顯著性差別。 2.不同濃度的胰島素對Colon26腫瘤細胞培養(yǎng)上清VEGF分泌的影響。G組(培養(yǎng)液含有125uIU/mL的胰島素)的VEGF濃度(27.7667±0.2517)明顯高于A組(對照組

7、)、E組、F組(培養(yǎng)液分別含有5uIU/mL,25uIU/mL的胰島素)的VEGF濃度(9.5583±0.2691,9.5833±0.0764,9.6167±0.1258),差異有顯著性,而A組、E組與F組之間無差異。 3.不同濃度的葡萄糖、胰島素對Colon26腫瘤細胞培養(yǎng)上清VEGF分泌的影響。K、L組(培養(yǎng)液均含有125 uIU/mL胰島素)的VEGF濃度(27.8333±0.3512,27.6000±0.6557)均明顯

8、高于A組的VEGF濃度(9.5583±0.2691),差異有顯著性,而K、L組組間無差異。H、M、N組(培養(yǎng)液分別含有5 uIU/mL,5uIU/mL,1.25ulU/mL的胰島素)的VEGF濃度(9.7167±0.00289,9.8667±0.0577,9.90±0.1732)與A組相比無顯著性差別。 4.VEGF mRNA的表達水平與上清中VEGF的分泌水平一致。經過瓊脂糖凝膠電泳擴增產物,紫外透射儀下觀察并拍照,同時用計算

9、機軟件進行圖像灰度掃描半定量分析。可以看到G、K、L組(培養(yǎng)液含有125uIU/mL的胰島素)的VEGF mRNA電泳條帶與A組(對照組)的VEGF mRNA的電泳條帶相比明顯增粗變亮,VEGF mRNA的表達水平(0.8802±0.19;0.8605±0.18;0.8569±0.22)與A組(對照組)VEGF mRNA的表達水平(0.4653±0.02)相比有統(tǒng)計學意義。而其他組與對照組相比電泳條帶在寬度和亮度上沒有差異,VEGF m

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