不同濃度葡萄糖與葡萄糖波動對大鼠腎系膜細(xì)胞損傷及RAGE表達(dá)的影響.pdf

1、研究背景及目的：糖尿病腎病（Diabetic nephropathy，DN）是糖尿病主要的微血管并發(fā)癥之一，是導(dǎo)致糖尿病患者死亡的重要原因，其發(fā)病機(jī)制至今尚未完全闡明，其中高血糖的毒性作用是最重要的因素之一。以往無論是臨床還是基礎(chǔ)研究都比較重視持續(xù)性高血糖。隨著研究的不斷深入，人們開始逐漸關(guān)注起了血糖波動引起的危害。近年研究表明，糖尿病的預(yù)后及慢性并發(fā)癥的發(fā)生和發(fā)展不僅與整體血糖水平的持續(xù)升高密切相關(guān)，而且與血糖波動性也有密切關(guān)系。本實(shí)

2、驗(yàn)旨在通過體外實(shí)驗(yàn)，用不同濃度的持續(xù)性葡萄糖和波動的葡萄糖同時作用于大鼠腎小球系膜細(xì)胞，并通過細(xì)胞形態(tài)觀察.氧化應(yīng)激和糖基化終未產(chǎn)物（Advanced glycation end products.AGEs）途徑相關(guān)指標(biāo)的檢測.觀察不同濃度葡萄糖對系膜細(xì)胞的作用，及葡萄糖濃度波動和持續(xù)穩(wěn)定高糖對系膜細(xì)胞產(chǎn)生作用的差異，探索波動性高血糖促進(jìn)DN的病理損傷機(jī)制，從而對臨床控制血糖的措施和防止DN的發(fā)生提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 方法：所有

3、實(shí)驗(yàn)均在體外培養(yǎng)的大鼠腎小球系膜細(xì)胞（GMC）上進(jìn)行。根據(jù)不同濃度葡萄糖和葡萄糖濃度波動及相關(guān)對照組分別處理細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)所用細(xì)胞分為6組，分別為正常對照組（N）、持續(xù)高糖組（H1和H2）、血糖濃度波動組（F）、總負(fù)載相同對照組（L）、滲透壓對照組（P），其中血糖濃度波動組（F）的細(xì)胞通過有規(guī)律地改變培養(yǎng)液中葡萄糖的濃度高低來建立血糖波動的環(huán)境。各組細(xì)胞分別培養(yǎng)24h、48h、72h后，進(jìn)行細(xì)胞學(xué)形態(tài)結(jié)構(gòu)觀察，MTT法測定細(xì)胞存活率，生化法

4、測定細(xì)胞培養(yǎng)上清液中超氧化物歧化酶（SOD）和丙二醛（MDA）的含量，RT-PCR檢測細(xì)胞晚期糖基化終末產(chǎn)物受體（RAGE）mRNA的表達(dá)情況。 結(jié)果： 1.細(xì)胞形態(tài)學(xué)與生存率：N組細(xì)胞呈單層鋪路石狀緊密排列。培養(yǎng)24h時，F(xiàn)組細(xì)胞呈現(xiàn)扁平狀，表現(xiàn)出抑制細(xì)胞增殖的作用，其余各組細(xì)胞變化不明顯；48h時，除N組外其余各組細(xì)胞形態(tài)均出現(xiàn)明顯改變，L、H1組在48h內(nèi)促進(jìn)細(xì)胞增殖，與N組有明顯的差異（P<0.05），其他各組多

5、數(shù)細(xì)胞由原來的飽滿梭形變?yōu)楠M長形或不規(guī)則形，與N組相比表現(xiàn)出不同程度的抑制系膜細(xì)胞增殖的作用（P<0.05），以F組最為顯著（P<0.01）；48h后高糖組（L、H1、H2）出現(xiàn)以劑量依賴形式抑制細(xì)胞增殖的作用。 2.SOD活性（U/ml）測定：24h時F組與L、H2組SOD活性指標(biāo)分別是12.97±1.86、14.37±0.81、12.99±1.34，各組之間比較均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），但F、H2組與N組（15.80±

6、0.88）、P組（15.47±0.72）比較，SOD活性明顯降低（P<0.05）；48h時，除P組外，其余各組SOD活性，與N組比較均降低，F(xiàn)組與H2、L、P組比較，也具有顯著差異和極顯著性差異（P<0.05和P<0.01）。P組與N組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。 3.MDA含量（μM）的測定：除P組外，其余各組細(xì)胞在24h及48h時均能使細(xì)胞上清液中MDA含量增加，顯著高于N組（P<0.01），且F組與高糖各組比較也具有

7、顯著性差異（P<0.05）。P組與N組無顯著性差異（P>0.05）。 4.所有標(biāo)本中均能檢測到RAGE mRNA的表達(dá)，24h時高糖各組和F組細(xì)胞表面RAGE表達(dá)含量已開始上調(diào)，都顯著高于N組（P<0.01），高糖各組和F組相比，出現(xiàn)不同程度差異（P<0.05，P<0.01）。48h時，F(xiàn)組與高糖組相比差異更加顯著（P<0.01）。P組細(xì)胞中RAGE mRNA的表達(dá)與N組表達(dá)無明顯差異。高糖組RAGE表達(dá)含量呈濃度時間依賴性。

8、 結(jié)論： 1.高糖在一定濃度和一定時段內(nèi)有刺激大鼠系膜細(xì)胞增殖的效應(yīng)，隨著時間的延長此效應(yīng)消失，并出現(xiàn)抑制細(xì)胞增殖的作用。波動性高血糖抑制大鼠系膜細(xì)胞增殖，且抗增殖作用大于持續(xù)性高葡萄糖濃度組。 2.細(xì)胞外高糖環(huán)境能損傷腎系膜細(xì)胞，表現(xiàn)在細(xì)胞生存率降低、MDA生成增加、SOD活性降低，呈一定濃度時間依賴性的氧化應(yīng)激損傷。 3.持續(xù)高糖環(huán)境對細(xì)胞造成了一定的損傷，但是葡萄糖濃度波動后這種損傷總體上明顯加劇。它