葡萄糖濃度波動(dòng)對(duì)INS-1細(xì)胞線粒體呼吸鏈功能的影響.pdf

1、2型糖尿?。╰ype 2 diabetes mellitus，T2DM）是目前嚴(yán)重影響人類健康的流行性疾病，近10余年來，人們對(duì)T2DM發(fā)病機(jī)制的認(rèn)識(shí)有了很大進(jìn)展，目前普遍認(rèn)為胰島β細(xì)胞功能缺陷和胰島素抵抗是T2DM的兩個(gè)重要發(fā)病機(jī)制，其中胰島β細(xì)胞功能缺陷在糖尿病的發(fā)生和發(fā)展中具有至關(guān)重要的作用。 高糖導(dǎo)致胰島β細(xì)胞功能紊亂的機(jī)制十分復(fù)雜，其中高糖所致細(xì)胞氧化應(yīng)激在其中發(fā)揮了重要的作用，已成為近年來的研究熱點(diǎn)。研究發(fā)現(xiàn)，慢性高

2、血糖導(dǎo)致糖尿病氧化應(yīng)激，機(jī)體活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）產(chǎn)量增多。Brownlee等的研究發(fā)現(xiàn)[1]，高糖導(dǎo)致線粒體呼吸鏈產(chǎn)生過多的氧自由基，進(jìn)而激活晚期糖基化終末產(chǎn)物（advanced glycation end products，AGEs）通路、己糖胺通路、多元醇途徑、蛋白激酶C （protein kinase C，PKC）通路等，后者進(jìn)一步促進(jìn)ROS的生成，從而形成惡性循環(huán)，加劇氧化損傷。由于

3、胰島β細(xì)胞的超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、過氧化氫酶（catalase，CAT）、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathion peroxidase，GPx）等抗氧化酶功能不足，因而更容易受到氧化損傷，并影響胰島素的合成和釋放，使葡萄糖刺激的胰島素分泌（Glucose Stimulated Insulin Secretion，GSIS）減少，因此，胰島β細(xì)胞功能紊亂與氧化應(yīng)激密切相關(guān)。 線粒體呼

4、吸鏈功能在胰島β細(xì)胞氧化損傷中發(fā)揮著十分重要的作用。在高糖環(huán)境下，β細(xì)胞內(nèi)葡萄糖的氧化增強(qiáng)，線粒體中還原當(dāng)量（NADH和FADH2）激增，線粒體內(nèi)膜兩側(cè)的質(zhì)子電化學(xué)電位梯度增加，電子在線粒體呼吸鏈中的傳遞速度減慢，電子與O2結(jié)合生成超氧陰離子自由基（·O2-）的機(jī)率也就相應(yīng)增加，當(dāng)超過呼吸鏈的處理能力時(shí)就會(huì)發(fā)生單電子傳遞，在呼吸鏈酶復(fù)合物Ⅰ、Ⅲ位點(diǎn)產(chǎn)生ROS。線粒體內(nèi)ROS產(chǎn)量增加也使呼吸鏈本身易成為氧化損傷的靶點(diǎn)。線粒體呼吸鏈不僅在胰

5、島β細(xì)胞氧化應(yīng)激過程中發(fā)揮著重要作用，也與胰島β細(xì)胞分泌功能密切聯(lián)系。NADH和FADH2提供的電子在線粒體呼吸鏈上傳遞的同時(shí)，酶復(fù)合物Ⅰ、Ⅲ和Ⅳ通過排出質(zhì)子建立質(zhì)子梯度，提供能量，這些能量在酶復(fù)合體Ⅴ的作用下轉(zhuǎn)化成ArP。在ATP存在的情況下，胞漿中鈣離子濃度升高和β細(xì)胞線粒體來源的一些偶聯(lián)因子共同促進(jìn)了胰島素的分泌。 目前有關(guān)高糖損傷β細(xì)胞胰島素分泌功能的文獻(xiàn)甚多，但并未有文獻(xiàn)涉及持續(xù)性和波動(dòng)性高糖對(duì)線粒體呼吸鏈酶復(fù)合物活性

6、的影響及后者與β細(xì)胞分泌胰島素功能的關(guān)系。本研究擬采用INS-1胰島β細(xì)胞株進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)，比較波動(dòng)性高糖和持續(xù)性高糖對(duì)β細(xì)胞胰島素分泌功能及線粒體呼吸鏈功能的影響，并觀察抗氧化劑對(duì)后二者的影響，以探討高糖對(duì)線粒體呼吸鏈功能影響的機(jī)制。 第一章、葡萄糖濃度波動(dòng)對(duì)INS-1細(xì)胞胰島素分泌功能的影響。 目的: 1.比較波動(dòng)性高糖和持續(xù)性高糖對(duì)rNS-1細(xì)胞胰島素分泌功能的影響； 2.探討抗氧化劑N-乙酰半胱氨酸

7、（N-acetyl-L-cysteine，NAC）對(duì)INS-1細(xì)胞胰島素分泌功能的影響。 方法: 1、分組: 將INS-1細(xì)胞按一定密度、隨機(jī)接種于六孔板中，分為： 1）正常糖組：5.5 mmol/L葡萄糖。 2）高糖組：16.7 mmol/L葡萄糖。 3）葡萄糖濃度波動(dòng)組：（16.7 mmol/L葡萄糖培養(yǎng)液×2h→更換5.5 mmol/L葡萄糖培養(yǎng)液×3 h）×3次→夜間9 h維持在5

8、.5 mmol/L葡萄糖培養(yǎng)液中 2、干預(yù): rNS-1細(xì)胞正常生長24 h后，換用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)24小時(shí)（血清饑餓）保持細(xì)胞同步生長，待細(xì)胞至對(duì)數(shù)生長期后，根據(jù)不同分組要求進(jìn)行相應(yīng)干預(yù)72h。 3、INS-1細(xì)胞胰島素分泌功能測(cè)定: 先后用2.8 mmol/L和16.7mmol/L葡萄糖刺激，用放免法測(cè)定基礎(chǔ)胰島素釋放（2.8 mmol/L）和高糖刺激胰島素釋放（16.7mmol/L）并計(jì)算GSIS，

9、結(jié)果以胰島細(xì)胞總蛋白校正。各組重復(fù)例數(shù)為5例。 4、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理: 用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，用Microsoft Excel軟件作圖。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，數(shù)據(jù)采用析因設(shè)計(jì)的方差分析，各組內(nèi)均數(shù)比較采用單向方差分析（One-way ANOVA），若方差不齊采用Welch近似方差分析；多重比較采用LSD法（Least-significant difference test），兩兩比較用，檢驗(yàn)。P<0.05

10、被認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)果： 高糖組（2.843±0.251）及波動(dòng)組（2.188±0.265）的GSIS較正常糖組（3.702±0.277）顯著降低（P<0.01，P<0.01），且波動(dòng)組較高糖組下降更顯著（P<0.01）。經(jīng)抗氧化劑NAC處理之后，NAC+波動(dòng)組（3.246±0.195）較波動(dòng)組的GSIS顯著改善（P<0.01），NAC+高糖組（3.342±0.178）較高糖組的GSIS顯著改善（P<0.01）

11、。 結(jié)論： 1、持續(xù)性高糖及波動(dòng)性高糖均損傷INS-1細(xì)胞的胰島素分泌功能，且波動(dòng)性高糖的影響更嚴(yán)重； 2、抗氧化劑NAC能顯著改善持續(xù)性高糖及波動(dòng)性高糖導(dǎo)致的INS-1細(xì)胞的胰島素分泌功能損傷，提示持續(xù)性高糖及波動(dòng)性高糖對(duì)INS-1細(xì)胞的損傷機(jī)制與氧化應(yīng)激有關(guān)。 第二章、葡萄糖濃度波動(dòng)對(duì)INS-1細(xì)胞線粒體呼吸鏈功能的影響。 目的： 1.探討波動(dòng)性高糖和持續(xù)性高糖對(duì)胰島β細(xì)胞線粒體呼吸鏈

12、功能的影響； 2.探討抗氧化劑NAC對(duì)INS-1細(xì)胞線粒體呼吸鏈功能的影響。 方法： 1.分組及干預(yù)同前。 2.熒光素酶方法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ATP含量，各組重復(fù)例數(shù)為5例。 3.分光光度計(jì)測(cè)定呼吸鏈酶復(fù)合物Ⅰ、Ⅲ活性，各組重復(fù)例數(shù)均為3例。 4.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，用Microsoft Excel軟件作圖。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，數(shù)據(jù)采用析因設(shè)計(jì)的方差分析，各

13、組內(nèi)均數(shù)比較采用單向方差分析（One-way ANOVA），若方差不齊采用Welch近似方差分析；多重比較采用LSD法（Least-significant difference test），兩兩比較用t檢驗(yàn)。P<0.05被認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)果： 1.持續(xù)性高糖及波動(dòng)性高糖對(duì)INS-1細(xì)胞內(nèi)ATP含量的影響（單位：nmol/mg protein）：培養(yǎng)72h后，高糖組（35.950±3.911）及波動(dòng)組（28.8

14、16±3.772）的ATP含量較正常糖組（47.058±4.535）降低（P<0.01，P<0.01），且波動(dòng)組較高糖組下降更顯著（P<0.05）。經(jīng)抗氧化劑NAC處理之后，NAC+波動(dòng)組（41.042±3.794）較波動(dòng)組的ATP含量顯著升高（P<0.01），NAC+高糖組（41.624士3.543）較高糖組的ATP含量顯著升高（P<0.01）。 2.持續(xù)性高糖及波動(dòng)性高糖對(duì)INS-1細(xì)胞的呼吸鏈酶復(fù)合物Ⅰ活性（單位：μmol

15、/mg pro·min）的影響：培養(yǎng)72h后，高糖組（1.531±0.236）及波動(dòng)組（0.952±0.246）的呼吸鏈酶復(fù)合物Ⅰ活性較正常糖組（2.308±0.329）降低（P<0.01，P<0.01），且波動(dòng)組較高糖組下降更顯著（P<0.05）。經(jīng)抗氧化劑NAC處理之后，NAC+波動(dòng)組（1.976±0.263）較波動(dòng)組的呼吸鏈酶復(fù)合物Ⅰ活性顯著改善P<0.01），NAC+高糖組（2.081±0.321）雖平均值較高糖組升高，但差異沒

16、有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。 3.持續(xù)性高糖及波動(dòng)性高糖對(duì)INS-1細(xì)胞的呼吸鏈酶復(fù)合物Ⅲ活性（單位：μmol/mg pro·min）的影響：培養(yǎng)72h后，高糖組（1.084±0.215）及波動(dòng)組（0.524±0.085）的呼吸鏈酶復(fù)合物Ⅰ活性較正常糖組（1.919±0.3 90）降低（P<0.01，P<0.01），且波動(dòng)組較高糖組下降更顯著（P<0.05）。經(jīng)抗氧化劑NAC處理之后，NAC+波動(dòng)組（1.629±0.265）較

17、波動(dòng)組的呼吸鏈酶復(fù)合物Ⅰ活性顯著改善（P<0.01），NAC+高糖組（1.664±0.3 67）雖平均值較高糖組升高，但差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。 結(jié)論： 1.波動(dòng)性高糖與持續(xù)性高糖均可降低呼吸鏈酶復(fù)合物Ⅰ、Ⅲ活性及ATP合成，且波動(dòng)性高糖較持續(xù)性高糖更嚴(yán)重；提示呼吸鏈功能的損傷可能是波動(dòng)性高糖與持續(xù)性糖導(dǎo)致INS-1細(xì)胞胰島素分泌功能受損的重要途徑之一； 2.抗氧化劑NAC能顯著改善高糖引起的呼吸鏈酶