Mibefradil對INS-1細(xì)胞糖毒性保護(hù)作用的初步研究.pdf

1、目的：
　　2型糖尿病是胰島β細(xì)胞的功能障礙和外周組織的胰島素抵抗為主要特征的一類代謝性疾病。長期高血糖對胰島細(xì)胞的胰島素合成、分泌以及存活等均產(chǎn)生不利的影響，其中涉及多種機(jī)制，包括體內(nèi)鈣離子平衡的破壞[1]。鈣離子平衡的紊亂對胰島β細(xì)胞生長/功能和胰島素分泌信號通路均會產(chǎn)生抑制作用[2]。
　　Mibefradil作為選擇性T型鈣通道拮抗劑，對T型鈣離子通道的阻滯效應(yīng)約為其對L型鈣離子通道阻滯效應(yīng)的30-100倍，最早作為

2、抗心絞痛、降壓藥物應(yīng)用于臨床，目前該藥物廣泛用于腫瘤、疼痛、癲癇等方面的研究，在糖尿病方面研究尚不深入。T型鈣通道是低電壓激活鈣離子通道，該通道僅需一個較低的電壓(約-70mv)即可被激活，因此是唯一一類允許鈣離子在膜靜息電位內(nèi)流的通道[3]。本課題組既往研究發(fā)現(xiàn)T型鈣通道在db/db小鼠（2型糖尿病模型小鼠，瘦素受體自發(fā)突變導(dǎo)致極度肥胖、多食、消渴、多尿等）肝臟、腦組織中表達(dá)明顯高于野生型小鼠，Mibefradil可明顯降低db/db

3、小鼠的血糖及血脂水平，但對正常小鼠則無明顯作用[4]。迄今為止，T型鈣通道特別是Mibefradil在胰島β細(xì)胞中的作用仍不清楚。因此本研究擬將高糖培養(yǎng)大鼠胰島素瘤細(xì)胞株(INS-1)作為研究對象，高糖培養(yǎng)細(xì)胞后Mibefradil干預(yù)INS-1細(xì)胞，采用NNC55-0396(NNC，僅拮抗T型鈣離子通道)、尼卡地平（Nic，僅拮抗L型鈣離子通道）作為對照藥物，觀察藥物對高糖培養(yǎng)INS-1細(xì)胞凋亡、胰島素分泌的作用，在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步觀察

4、其對INS-1細(xì)胞T型鈣通道cav3.1、cav3.2亞基表達(dá)的作用，以期初步探討Mibefradil對INS-1細(xì)胞功能的作用及其可能的機(jī)制。
　　方法:
　　本課題將INS-1細(xì)胞作為研究對象，利用CCK-8法檢測細(xì)胞增殖確定最佳高糖及藥物（Mibefradil、NNC55-0396、尼卡地平）作用濃度及時間后，高濃度葡萄糖(33.3 mmol/L)處理細(xì)胞構(gòu)建細(xì)胞高糖模型。將細(xì)胞分為正常培養(yǎng)組、高糖組、藥物組、高糖+藥

5、物組，流式細(xì)胞技術(shù)檢測細(xì)胞凋亡、放射免疫法檢測細(xì)胞胰島素分泌，以觀察藥物對INS-1細(xì)胞凋亡及胰島素分泌的作用，RT-PCR、Western-Blot檢測T型鈣通道cav3.1、cav3.2亞基基因及蛋白表達(dá)觀察藥物對其表達(dá)的作用。
　　結(jié)果:
　　1.與正常培養(yǎng)組相比，33.3mmol/L葡萄糖孵育細(xì)胞72h時，顯著抑制細(xì)胞增殖(P＜0.05);1μmol/L Mibefradil、1μmol/L NNC55-0396、1

6、0μmol/L尼卡地平作用24小時對細(xì)胞增殖無明顯抑制(P＞0.05)，在此基礎(chǔ)上增加藥物濃度或延長作用時間均可顯著抑制細(xì)胞增殖(P＜0.05)。
　　2.與正常培養(yǎng)組相比，高糖組細(xì)胞凋亡明顯增加(P＜0.05);較高糖培養(yǎng)組，高糖+Mibefraidl組、高糖+NNC55-0396組、高糖+尼卡地平組以及高糖+NNC55-0396+尼卡地平組細(xì)胞凋亡無顯著差異(P＞0.05)。
　　3.與正常培養(yǎng)組相比，藥物組細(xì)胞基礎(chǔ)胰島

7、素分泌（3.3mmol/L葡萄糖刺激）及葡萄糖刺激胰島素分泌（16.7mmol/L葡萄糖刺激）均無顯著差異(P＞0.05)。與高糖組相比，僅高糖+Mibefradil組顯著降低細(xì)胞胰島素分泌（基礎(chǔ)分泌以及葡萄糖刺激胰島素分泌）(P＜0.05)。
　　4.1)高糖(33.3 mmol/L)作用于INS-1細(xì)胞72小時顯著升高cav3.1、cav3.2亞基基因及蛋白表達(dá)(P＜0.05)。2)與正常培養(yǎng)組相比，Mibefradil組T型

8、鈣通道cav3.1、cav3.2亞基的基因及蛋白表達(dá)無顯著差異(P＞0.05);而與高糖培養(yǎng)組相比，高糖+Mibefrail組顯著降低T型鈣通道cav3.1、cav3.2亞基的基因及蛋白表達(dá)(P＜0.05)。
　　結(jié)論:
　　1.本實(shí)驗中Mibefradil、NNC55-0396、尼卡地平對高糖誘導(dǎo)的INS-1細(xì)胞凋亡無明顯保護(hù)作用。
　　2.Mibefradil可顯著抑制高糖作用下INS-1細(xì)胞胰島素分泌，同時對正常

9、培養(yǎng)的INS-1細(xì)胞無此作用;
　　3.高糖可增加INS-1細(xì)胞中T型鈣通道cav3.1、cav3.2亞基基因及蛋白表達(dá);
　　4.Mibefradil可顯著抑制高糖培養(yǎng)下INS-1細(xì)胞T型鈣通道cav3.1、cav3.2亞基的基因及蛋白表達(dá)，而對正常培養(yǎng)的INS-1細(xì)胞無明顯作用。
　　上述結(jié)果提示Mibefradil對正常培養(yǎng)下1NS-1細(xì)胞胰島素分泌以及cav3.1、cav3.2亞基基因及蛋白表達(dá)均無明顯作用，僅