菩人丹對糖脂毒導(dǎo)致的INS-1細胞損傷的修復(fù)作用及機制研究.pdf

1、背景:
　　 2型糖尿病是嚴重危害人類健康的重大疑難疾病。胰島β細胞功能的衰竭和胰島素抵抗是其主要發(fā)病機制，其中胰島β細胞數(shù)量的異常減少和胰島素分泌功能的下降是導(dǎo)致2型糖尿病發(fā)生和發(fā)展的關(guān)鍵因素。葡萄糖和脂肪雖然是機體必需的營養(yǎng)物質(zhì)，但是長期高水平的葡萄糖和游離脂肪酸將造成胰島β細胞損傷，致使細胞發(fā)生凋亡并逐步喪失胰島素分泌的功能，最終導(dǎo)致2型糖尿病的不可逆發(fā)生。而胰島β細胞上的胰島素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，調(diào)控著β細胞的增殖、分化和胰島

2、素的合成、分泌，在機體糖脂代謝中發(fā)揮著重要作用。我國傳統(tǒng)中醫(yī)藥治療糖尿病已有上千年的歷史，中藥復(fù)方多靶點、多途徑的作用特點，以及較少的毒副作用，在預(yù)防糖尿病發(fā)生以及并發(fā)癥出現(xiàn)方面具有顯著優(yōu)勢。
　　 目的:
　　 本實驗試圖通過體外實驗研究，證實高濃度葡萄糖、軟脂酸及軟脂酸+高糖對胰島β細胞的損傷作用及其差異。在此基礎(chǔ)上考察“益氣養(yǎng)陰清熱、活血化瘀通絡(luò)”中藥復(fù)方菩人丹對胰島β細胞活力、凋亡以及胰島素分泌的影響，闡明菩人丹

3、保護胰島β細胞“質(zhì)”“量”之功效，并從分子水平研究菩人丹對胰島β細胞胰島素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中IRS2/PI3K/Akt通路的影響，揭示菩人丹修復(fù)“糖脂毒”導(dǎo)致的胰島β細胞損傷的作用機制。
　　 [方法]
　　 選取大鼠胰島素瘤細胞系INS-1細胞為胰島β細胞的體外研究對象，以33.3 mM葡萄糖、0.5 mM軟脂酸及0.5 mM軟脂酸合并33.3 mM葡萄糖分別構(gòu)建糖毒性、脂毒性及糖脂毒性β細胞損傷模型。在各損傷模型基礎(chǔ)上，分別

4、給予5％菩人丹含藥血清、10％菩人丹含藥血清干預(yù)24小時，并以10％二甲雙胍含藥血清為陽性對照。采用CCK-8試劑盒檢測INS-1細胞活力;Hoechst熒光染色法和流式Annexin V-FITC/PI雙染法檢測細胞凋亡;caspase-3和caspase-8活性檢測試劑盒檢測細胞caspase-3/-8活性;葡萄糖刺激胰島素釋放實驗檢測INS-1細胞的胰島素分泌;采用Western blot法分析胰島素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路相關(guān)蛋白IRS2、

5、Akt、BAD、FOXO1、mTOR、P70s6k和PTP1B的蛋白質(zhì)表達水平，以及IRS2(ser731)、Akt(thr308)、BAD(ser136)、FOXO1(ser256)、mTOR(ser2448)和P70s6k(thr389)的磷酸化水平。
　　 結(jié)果:
　　 1.三種模型的特點和胰島素分泌功能變化規(guī)律:
　　 (1)33.3 mM葡萄糖作用于INS-1細胞，12小時后，與對照組比較細胞活力(P=

6、0.013)和細胞BIS以及GSIS均顯著升高(BIS: P＜0.001，GSIS:P=0.046);培養(yǎng)24小時后，細胞活力和胰島素分泌出現(xiàn)下降(P＜0.001)，其降低呈現(xiàn)時間依賴性;此時出現(xiàn)明顯的細胞凋亡(P＜0.001)。
　　 (2)0.5 mM軟脂酸作用于INS-1細胞，6小時后細胞活力即開始下降，但此時細胞BIS有所升高，然而二者變化均無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05);培養(yǎng)24小時后，細胞活力和GSIS均明顯降低(P＜

7、0.001)，但BIS則明顯升高(P=0.001);同時觀察到明顯的細胞凋亡(P＜0.001)，且凋亡率大于高糖損傷細胞。
　　 (3)0.5 mM軟脂酸和33.3 mM葡萄糖同時作用于INS-1細胞，6小時后，細胞活力和GSIS即出現(xiàn)顯著降低（細胞活力:P=0.041;GSIS:P＜0.001），細胞BIS在12小時后也開始顯著下降(P＜0.001)，其下降呈現(xiàn)時間依賴性;細胞凋亡率則遠高于單純高糖組和軟脂酸組。
　　

8、 2.菩人丹對糖脂損傷INS-1細胞的保護作用:
　　 (1)菩人丹對糖脂損傷INS-1細胞的活力影響:高糖、軟脂酸、軟脂酸+高糖均使INS-1細胞活力顯著降低（vs.對照組，P＜0.001）。低劑量菩人丹對損傷細胞的活力無明顯作用（vs.模型組，P＞0.05），而高劑量菩人丹可使細胞活力明顯升高（vs.模型組，P=0.003或P＜0.001），作用效果與陽性對照藥二甲雙胍相當(dāng)。
　　 (2)菩人丹對糖脂損傷INS-1細

9、胞凋亡的影響:高糖、軟脂酸、軟脂酸合并高糖均明顯促進INS-1細胞的凋亡（vs.對照組，P＜0.001），升高caspase-3和caspase-8的活性。低劑量菩人丹對細胞凋亡無明顯作用(vs.模型組，P＞0.05)，而高劑量菩人丹可顯著降低caspase-3和caspase-8的活性，抑制細胞凋亡（vs.模型組，P＜0.001），并與陽性對照藥二甲雙胍作用效果相當(dāng)。
　　 (3)菩人丹對糖脂損傷INS-1細胞胰島素分泌的影響

10、:高糖、軟脂酸合并高糖使INS-1細胞的BIS和GSIS降低（vs.對照組，P＜0.001），而軟脂酸使INS-1細胞GSIS降低的同時（vs.對照組，P＜0.001），使BIS升高(vs.對照組，P=0.012)。低劑量菩人丹對細胞胰島素分泌無顯著影響(vs.模型組，P＞0.05)，而高劑量菩人丹可明顯增加糖脂損傷INS-1細胞的BIS及GSIS(vs.模型組，P＜0.001)，對軟脂酸導(dǎo)致的細胞BIS上升雖有所抑制，但差異無統(tǒng)計學(xué)意

11、義(vs.模型組，P=0.099)。菩人丹對糖脂損傷INS-1細胞胰島素分泌的作用效果與二甲雙胍相當(dāng)。
　　 3.菩人丹對INS-1細胞胰島素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的影響:
　　 高糖、軟脂酸、軟脂酸合并高糖均可顯著下調(diào)IRS2蛋白質(zhì)表達水平(P＜0.001)，降低Akt(thr308)、BAD(ser136)、FOXO1(ser256)、mTOR(ser2448)和P70s6k(thr389)的磷酸化水平(P＜0.001)，上調(diào)

12、FOXO1和PTP1B的蛋白質(zhì)表達，升高IRS2(ser731)磷酸化水平(P＜0.001)。菩人丹干預(yù)24小時后，促進了各損傷模型細胞IRS2的蛋白表達(P＜0.001)以及Akt(thr308)、BAD(ser136)、FOXO1(ser256)、mTOR(ser2448)和P70s6k(thr389)的磷酸化(P＜0.001)，同時抑制了FOXO1和PTP1B的蛋白質(zhì)表達(P＜0.001)以及IRS2(ser731)的磷酸化(P＜

13、0.001)，并且與陽性對照藥二甲雙胍作用效果相當(dāng)。
　　 結(jié)論:
　　 1.高濃度葡萄糖在短時間內(nèi)可以促進INS-1細胞的增殖和胰島素分泌，而持續(xù)高糖則表現(xiàn)出促進細胞凋亡、抑制細胞活力和胰島素分泌的作用，并且對GSIS的影響較BIS更為顯著;軟脂酸可抑制INS-1細胞活力，促進細胞凋亡，并且在短時間內(nèi)可輕微增加胰島素分泌，但長時間作用表現(xiàn)為增加細胞BIS而抑制GSIS;軟脂酸合并高糖可抑制INS-1細胞活力、促進細胞凋

14、亡、降低胰島素分泌，且作用強于單純高糖和軟脂酸，對INS-1細胞的損傷具有協(xié)同性和疊加性。
　　 2.菩人丹可以顯著抑制糖毒性、脂毒性和糖脂毒性導(dǎo)致的胰島β細胞凋亡、提高細胞活力、降低caspase-3和caspase-8活性、促進β細胞葡萄糖刺激的胰島素分泌，保護β細胞的“質(zhì)”和“量”，從而發(fā)揮菩人丹“益氣養(yǎng)陰清熱、活性化瘀通絡(luò)”治療2型糖尿病之功效。
　　 3.菩人丹可以減少“糖脂毒”損傷INS-1細胞IRS2蛋白的

15、異常降解和絲氨酸(ser731)磷酸化，保證足量的IRS2可以被胰島素受體的酪氨酸激酶活化，繼而減輕糖脂毒對胰島β細胞Akt活性的抑制作用，使Akt蘇氨酸(thr308)磷酸化增強，激活胰島素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)中的PI3K/Akt通路，將胰島素信號繼續(xù)向下游傳遞，使下游效應(yīng)因子BAD、FOXO1、mTOR和P70s6k被活化，得以發(fā)揮其各自的生物學(xué)功能，從而抑制“糖脂毒”對胰島β細胞凋亡的促進作用、修復(fù)“糖脂毒”導(dǎo)致的胰島素分泌損傷，改善“糖