高表達MicroRNA-126誘導INS-1細胞凋亡的研究.pdf

1、研究背景：糖尿病是以外周器官組織對胰島素反應(yīng)性降低和β細胞分泌胰島素障礙為特征的代謝性疾病。隨著生活水平和社會環(huán)境的改變，糖尿病的發(fā)病率逐年上升。正常β細胞的胰島素分泌功能存在自反饋調(diào)節(jié)，以促進β細胞水平的胰島素合成和分泌，β細胞的衰老及凋亡均使胰島素分泌減少，也參與DM2的發(fā)病過程。有報道胰島素信號通路可能存在miR-126的作用靶點。但是miR-126能否影響胰島β細胞凋亡及增殖目前尚不明確，本課題在INS-1細胞模型過表達和低表達

2、miRNA-126，觀察對INS-1細胞凋亡和增殖的影響。
　　方法：1、本實驗以培養(yǎng)的INS-1細胞為模型，將其分別轉(zhuǎn)染40nM的不同miRNA48小時，人工合成胰島素100nM刺激細胞12小時。并用實時熒光定量PCR方法檢測干擾INS-1細胞miR-126表達的效果。2、實驗分為四組：A、陰性對照組（轉(zhuǎn)染nonsense segment，NC），B、miR-126過表達組（轉(zhuǎn)染miR-126 mimic），C、miR-126低

3、表達組（轉(zhuǎn)染miR-126 inhibitor），D、miR-375 mimic（陽性對照組）3、應(yīng)用流式細胞儀、MTS等方法檢測細胞凋亡和細胞活力變化；電子顯微鏡下觀察細胞超微結(jié)構(gòu)改變；免疫熒光細胞化學染色法檢測凋亡相關(guān)蛋白Omi/HtrA2、XIAP和caspase-3的表達部位，以及利用定量技術(shù)ImagePro-Plus分析軟件測定上述蛋白熒光強度值；利用Western Blot方法檢測XIAP蛋白表達的變化。
　　結(jié)果：1

4、、實時熒光定量PCR檢測顯示：miR-126在NC、miR-126 mimics、miR-126 inhib itor三組中的相對表達量分別為221.45±23.08（n=3）、52.84±15.78（n=3）、10.86±2.52（n=3）。過表達組miR-126的表達量顯著高于陰性對照組（P<0.05），miR-126低表達顯著低于陰性對照組（P<0.05）。
　　2、流式細胞儀檢測結(jié)果顯示：miR-126 mimic組和mi

5、R-375 mimic組INS-1細胞凋亡數(shù)均顯著高于NC組和miR-126 inhibitor組（P<0.05），而miR-126 mimic組凋亡細胞數(shù)與miR-375 mimic組間無明顯差異（P>0.05），NC組凋亡細胞數(shù)和miR-126 inhibitor組間無明顯差異（P>0.05）；與之相應(yīng)，MTS法檢測INS-1細胞活力顯示：miR-126 mimic組和miR-375 mimic組中細胞活力明顯下降，低于NC組和mi

6、R-126 inhibitor組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），miR-126 mimic組細胞活力與miR-375 mimic組間無明顯差異（P>0.05），NC組細胞活力和miR-126 inhibitor組間無明顯差異（P>0.05）；
　　3、電鏡下可見：過表達組眾多INS-1壞死細胞，多數(shù)細胞體積變小，細胞核折縫樣改變，染色質(zhì)高度濃縮、邊集；線粒體空泡化改變，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴張，部分與細胞膜融合，出現(xiàn)發(fā)泡現(xiàn)象。NC組和低表達

7、miR-126組偶見壞死細胞，多數(shù)細胞的亞細胞結(jié)構(gòu)完整。
　　4、細胞免疫熒光結(jié)果顯示四組INS-1細胞均有Omi/HtrA2和caspase-3蛋白表達，而XIAP蛋白表達僅限于胞核。Western Blot檢測結(jié)果顯示miR-126mimics組XIAP蛋白表達量分別明顯低于NC組和miR-126 inhibitor組。
　　結(jié)論：1、過表達miR-126、miR-375可以誘導INS-1細胞凋亡；
　　2、過表達