自噬在過表達TXNIP誘導(dǎo)的INS-1胰島細胞凋亡中的作用.pdf

1、研究背景：
　　隨著人口老齡化的發(fā)展，慢性疾病的發(fā)生率顯著提高，其中糖尿病已成為威脅我國人民健康的最重要疾病之一。2010年楊文英和2013年寧光教授的研究均顯示，我國已取代印度成為全球糖尿病患者人數(shù)最高的國家，而且糖尿病的發(fā)病率仍呈快速上升趨勢，并向中青年，甚至兒童蔓延。不論1型或2型糖尿病，各種原因?qū)е碌囊葝uβ細胞數(shù)目減少和功能異常均是其發(fā)生和發(fā)展的重要原因。
　　硫氧還蛋白相互作用蛋白（Trx interacting

2、protein，TXNIP）在糖尿病的發(fā)病機制研究中的作用日益引起關(guān)注，它是目前已知唯一一個內(nèi)源性硫氧還蛋白(Trx)結(jié)合及抑制蛋白，在糖尿病患者血清和組織中均呈現(xiàn)高表達。我們和他人課題組均研究證實了單純過表達TXNIP可以通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)的途徑、死亡受體途徑和線粒體凋亡途徑引起INS-1細胞凋亡增高。
　　自噬是在大部分真核細胞中經(jīng)常觀察到的一種生命現(xiàn)象，可以清除降解細胞內(nèi)受損的細胞器和不需要的生物大分子等以維持細胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)

3、態(tài)，減少細胞凋亡并起到保護細胞的作用，但也有研究表明，自噬水平的過度激活可促進凋亡的發(fā)生，而對器官組織造成額外的損傷。那么，TXNIP的升高對于自噬有何影響？其在TXNIP誘導(dǎo)的胰島β細胞凋亡中又有何作用？本研究將對這兩個問題進行探討。
　　目的：
　　本實驗旨在運用腺病毒轉(zhuǎn)染技術(shù)建立TXNIP過表達INS-1胰島細胞模型，觀察正常培養(yǎng)條件下單純過表達TXNIP的INS-1胰島細胞自噬水平的變化，以及探討自噬在TXNIP誘導(dǎo)

4、的INS-1胰島細胞凋亡中的作用。
　　方法：
　　1.使用腺病毒轉(zhuǎn)染技術(shù)對INS-1胰島細胞建立過表達TXNIP模型
　　選用處于對數(shù)生長期的INS-1胰島細胞，在25cm×25cm的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，待細胞長滿視野范圍80％時細胞數(shù)量約為2×106個，棄掉培養(yǎng)基，PBS沖洗兩次倒掉，隨機分為3組，即正常培養(yǎng)組（Control），不含TXNIP的空載體腺病毒對照組（Ad-eGFP），含有TXNIP的過表達組（Ad-TXN

5、IP-eGFP）。按感染復(fù)數(shù)MOI=50計算病毒量進行病毒轉(zhuǎn)染，先將計算出的病毒體積加入1ml的1640中培養(yǎng)細胞，4h后補3ml含有10%胎牛血清和雙抗的1640繼續(xù)培養(yǎng)，于48小時轉(zhuǎn)染效率最高時收集細胞。
　　2.檢測指標
　　2.1應(yīng)用實時定量PCR和Western blot方法檢測INS-1胰島細胞TXNIP mRNA的水平以及蛋白表達量。
　　2.2用流式細胞術(shù)檢測各組細胞凋亡情況。
　　2.3應(yīng)用We

6、stern blot方法測定各組細胞中LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、Beclin-1、P62以及cleaved caspase3/caspase3的表達。
　　2.4使用激光共聚焦顯微鏡觀察自噬體的變化。
　　結(jié)果：
　　1. INS-1胰島細胞過表達TXNIP成功
　　與Control組相比，Ad-eGFP組TXNIP mRNA和蛋白水平未見明顯差別，與Ad-eGFP組相比，Ad-TXNIP-eGFP組TXNIP m

7、RNA（圖1）和蛋白水平明顯增高（圖2），說明病毒構(gòu)建成功、病毒轉(zhuǎn)染目的蛋白造模成功。
　　2.過表達TXNIP引起INS-1胰島細胞凋亡增加。
　　使用 Annexin V-APC/7-AAD染色經(jīng)流式細胞術(shù)檢測凋亡表明Ad-TXNIP-eGFP組細胞凋亡率增多：與Ad-eGFP組相比，Ad-TXNIP-eGFP組細胞凋亡率增多，而Ad-eGFP組與Control組無明顯差異（圖4）。
　　Ad-TXNIP-eGFP

8、組cleaved caspase3/caspase3比值增高:cleaved caspase3的生成是凋亡的共同通路，與Control組相比， Ad-eGFP組cleaved caspase3/caspase3比值未見統(tǒng)計學差異；與Ad-eGFP組相比，Ad-TXNIP-eGFP組顯著增高（圖3），進一步證實了TXNIP的上調(diào)可引起INS-1胰島細胞的凋亡增加。3. TXNIP表達上調(diào)可引起INS-1胰島細胞自噬水平的升高。
　　

9、與Control組相比， Ad-eGFP組的自噬標志物LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ蛋白水平、Beclin-1蛋白水平未見明顯差別，與Ad-eGFP相比，Ad-TXNIP-eGFP組LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ蛋白水平是升高的（圖5），Beclin-1蛋白水平也增多（圖6），二者增多說明自噬反應(yīng)生成增多。由于P62是自噬降解的底物，隨自噬的加強，其水平逐漸降低，是自噬檢測的常用標志物，與Control組相比，Ad-eGFP組P62蛋白水平未見統(tǒng)計學差

10、異，與Ad-eGFP組相比，Ad-TXNIP-eGFP組P62蛋白水平降低（圖7），表明自噬溶酶體降解增多，自噬反應(yīng)增多。
　　4.激光共聚焦顯微鏡下觀察到Ad-TXNIP-eGFP組自噬體增多
　　使用LC3B多克隆抗體對自噬細胞進行染色，共聚焦顯微鏡下攝片并分析：Control組和Ad-eGFP組之間染色所呈的紅色熒光無顯著差別，均很弱；與Control組和Ad-eGFP組相比，Ad-TXNIP-eGFP組自噬熒光顯著增

11、強，細胞內(nèi)出現(xiàn)了明顯的紅色熒光，表明過表達TXNIP促進自噬體生成（圖8）。
　　5.3-MA（5mM）抑制自噬后TXNIP上調(diào)引起的INS-1胰島細胞凋亡減少。
　　5.13-MA（5mM）抑制了TXNIP上調(diào)引起的INS-1胰島細胞自噬水平的升高。
　　為了證實自噬的改變在TXNIP上調(diào)引起的INS-1胰島細胞凋亡中的作用，采用了自噬抑制劑3-methyladenine(3-MA)進行干預(yù)，將細胞進一步分組為：Co

12、ntrol組、Ad-eGFP組、Ad-TXNIP-eGFP組、Control+3-MA組、Ad-eGFP+3-MA組、Ad-TXNIP-eGFP+3-MA組，對前述幾個自噬標志物的檢測結(jié)果顯示：Control+3-MA與Control組相比無統(tǒng)計學差異；Ad-eGFP+3-MA組與Ad-eGFP組相比也無統(tǒng)計學差異；與Ad-TXNIP-eGFP組相比，Ad-TXNIP-eGFP+3-MA組LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值明顯降低（圖9），Be

13、clin-1表達明顯降低（圖10），而P62表達明顯增多（圖11），以上結(jié)果說明，3-MA抑制了TXNIP過表達誘導(dǎo)的自噬發(fā)生。
　　5.2自噬抑制后TXNIP上調(diào)引起的INS-1胰島細胞凋亡減少。
　　使用 Annexin V-APC/7-AAD染色，流式細胞術(shù)檢測凋亡的結(jié)果顯示：Control+3MA組與Control組相比無統(tǒng)計學差異；Ad-eGFP+3-MA組與Ad-eGFP組相比無統(tǒng)計學差異；Ad-TXNIP-eG

14、FP+3-MA組與 Ad-TXNIP-eGFP組相比INS-1細胞凋亡減輕（圖13）。使用Western blot對cleaved caspase3/caspase3的檢測也取得類似結(jié)果，Ad-TXNIP-eGFP+3MA組cleaved caspase3/caspase3比值明顯降低（圖12），同樣表明使用自噬抑制劑后，TXNIP誘導(dǎo)的細胞凋亡減輕。
　　結(jié)論：
　　1.在INS-1細胞單純過表達TXNIP可以誘導(dǎo)自噬增加