GLP-1對(duì)IL-1β誘導(dǎo)INS-1細(xì)胞損傷的保護(hù)作用及機(jī)制初探.pdf

1、[背景]
　　 隨著世界經(jīng)濟(jì)的發(fā)展,人們生活水平的提高,全球人類健康面臨的糖尿病威脅正日益增加,已成為嚴(yán)重威脅人類健康的世界性公共衛(wèi)生問(wèn)題,也給個(gè)人、家庭和社會(huì)帶來(lái)了極大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。早期預(yù)防、早期干預(yù)無(wú)疑是解決這類問(wèn)題的理想措施。
　　 2型糖尿病(Type 2 diabetes mellitus,T2DM)患者占全部糖尿病患者的絕大多數(shù),其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜,至今未被完全闡明。T2DM的發(fā)病基礎(chǔ)是胰島素抵抗和胰島素分泌缺陷,

2、但誰(shuí)起主導(dǎo)作用仍存爭(zhēng)議。過(guò)去認(rèn)為胰島素抵抗占主導(dǎo)地位,近來(lái),越來(lái)越多研究提示胰島素分泌缺陷在T2DM的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。前期研究提示高糖、高脂能破壞胰島β細(xì)胞的分泌功能和減少胰島β細(xì)胞量,所以與胰島素分泌缺陷關(guān)系密切。
　　 近期研究提示2型糖尿病是一種慢性低度炎癥性疾病。作為炎癥過(guò)程的重要調(diào)節(jié)因子,白細(xì)胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)與2型糖尿病的關(guān)系日益引起重視。IL-1β不僅是由脂肪細(xì)胞、巨噬細(xì)

3、胞、內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生和分泌的,而且胰島β細(xì)胞自身具有分泌IL-1β的功能。
　　 IL-1β具有廣泛的生物學(xué)效應(yīng),在介導(dǎo)β細(xì)胞損傷中起著重要作用。一方面IL-1β抑制胰島素的合成與釋放；另一方面IL-1β促進(jìn)胰島β細(xì)胞的死亡。IL-1β不但介導(dǎo)白細(xì)胞間的相互作用,還參與了其他細(xì)胞的調(diào)節(jié),并與其他細(xì)胞因子相互影響,相互制約,構(gòu)成一個(gè)復(fù)雜的細(xì)胞因子調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò),進(jìn)一步加重胰島β細(xì)胞的損傷。
　　 因此,在目前T2DM的治療過(guò)程中,抑

4、制IL-1β對(duì)胰島β細(xì)胞的損傷作用對(duì)維持一定數(shù)量有功能的胰島β細(xì)胞,延緩糖尿病的發(fā)生發(fā)展十分重要。
　　 胰高血糖素樣肽-1(GLP-1)是1983年在分析胰高血糖素的前體基因-胰高血糖素原(proglucagon,GP)基因序列時(shí)被發(fā)現(xiàn)的。該基因可在胰腺的α細(xì)胞、腸道的L細(xì)胞內(nèi)表達(dá)。GLP-1由30個(gè)氨基酸組成,主要的生物活性型是GLP-1(7-36)。它的受體廣泛分布于全身各個(gè)組織器官,被激活后產(chǎn)生多種生物學(xué)效應(yīng)。
　

5、　 GLP-1受體激動(dòng)劑對(duì)胰腺本身產(chǎn)生的生物學(xué)效應(yīng):一方面增加胰島素的分泌和合成功能,另一方面可以增加胰島β細(xì)胞量,主要表現(xiàn)為增加胰島β細(xì)胞的增殖、增加胰島β細(xì)胞的新生、抑制胰島β細(xì)胞的凋亡。
　　 近期研究提示,GLP-1可以抑制高糖誘導(dǎo)的人胰島β細(xì)胞和大鼠胰島β細(xì)胞株INS832/13細(xì)胞的凋亡,其機(jī)制主要是GLP-1激活的PI-3K/PKB通路,誘導(dǎo)抗凋亡基因IAP-2(inhibitor of apoptosis pr

6、otein-2)和BCL-2的表達(dá)增加。
　　 T2DM患者胰島β細(xì)胞內(nèi)IL-1β的表達(dá)顯著高于正常對(duì)照組,進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)高糖和IL-1β自身能增加胰島內(nèi)IL-1β的表達(dá),且與NF-kB的激活有關(guān),而IL-1受體拮抗劑(IL-1 receptor antagonist,IL-1Ra)能顯著抑制IL-1β的表達(dá)。提示高糖和IL-1β自身可以刺激胰島β細(xì)胞生成和分泌IL-1β。
　　 研究表明,表兒茶精(epicatechi

7、n)能通過(guò)阻斷NF-kB信號(hào)通路的激活,抑制IL-1β對(duì)胰島β細(xì)胞系RINm5F和大鼠胰島的細(xì)胞毒性。另外,通過(guò)包含IkB抑制劑的腺病毒轉(zhuǎn)染β細(xì)胞系、大鼠及人的胰島均能降低由IL-1β引起的細(xì)胞凋亡。IL-1β可以激活大鼠胰島NF-kB信號(hào)通路,誘導(dǎo)COX-2和前列腺素受體3(EP3)基因的表達(dá)增加,導(dǎo)致胰島β細(xì)胞的分泌功能下降,而水楊酸鈉可以通過(guò)抑制IL-1β對(duì)NF-kβ信號(hào)通路的激活,恢復(fù)胰島β細(xì)胞的分泌功能。說(shuō)明NF-kB通路的激

8、活與IL-1β誘導(dǎo)的胰島β細(xì)胞損傷關(guān)系密切。
　　 前述提示,T2DM是一個(gè)慢性低度炎癥性疾病,其胰島內(nèi)局部IL-1β表達(dá)增加,這可能與高糖和胰島自身分泌的IL-1β誘導(dǎo)有關(guān),而NF-Kβ通路的激活與IL-1β誘導(dǎo)的β細(xì)胞損傷關(guān)系密切。GLP-1能抑制高糖對(duì)胰島β細(xì)胞的損傷作用,這是否與GLP-1抑制IL-1β對(duì)胰島β細(xì)胞的損傷作用有關(guān)呢?其機(jī)制是否與抑制IL-1β誘導(dǎo)NF-κB的激活有關(guān)呢?目前這方面的研究較少。
　　

9、 本課題以大鼠胰島細(xì)胞瘤系INS-1細(xì)胞為研究對(duì)象,觀察GLP-1對(duì)IL-1β誘導(dǎo)INS-1細(xì)胞損傷的保護(hù)作用并探討其部分保護(hù)機(jī)制。以期為GLP-1在2型糖尿病治療中的應(yīng)用提供更多的理論支持。
　　 具體研究?jī)?nèi)容分為以下兩個(gè)部分:
　　 第一章GLP-1對(duì)IL-1β誘導(dǎo)INS-1細(xì)胞損傷的保護(hù)作用
　　 [目的]
　　 觀察GLP-1對(duì)IL-1β誘導(dǎo)INS-1細(xì)胞損傷的保護(hù)作用。
　　 [研究對(duì)象

10、和方法]
　　 1、以大鼠胰島細(xì)胞瘤株INS-1細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)對(duì)象:
　　 2、實(shí)驗(yàn)分組
　　 IL-1β濃度梯度分組(4組)
　　 第1組:0ng/ml rIL-1β干預(yù)INS-1細(xì)胞組,簡(jiǎn)稱0組；
　　 第2組:1ng/ml rIL-1β干預(yù)INS-1細(xì)胞組,簡(jiǎn)稱1組；
　　 第3組:5ng/ml rIL-1β干預(yù)INS-1細(xì)胞組,簡(jiǎn)稱5組；
　　 第4組:10ng/ml rIL-

11、1β干預(yù)INS-1細(xì)胞組,簡(jiǎn)稱10組。
　　 各干預(yù)組分組(3組)
　　 第1組:正常對(duì)照組(Untreated group),以下簡(jiǎn)稱對(duì)照組；
　　 第2組:10ng/ml rIL-1β干預(yù)INS-1細(xì)胞組,以下簡(jiǎn)稱IL-1β組；
　　 第3組:在10ng/ml rIL-1β干預(yù)INS-1細(xì)胞前,予以hGLP-1預(yù)處理18小時(shí),且間隔12小時(shí)追加一次相同劑量的hGLP-1,以下簡(jiǎn)稱GLP-1+IL-1β

12、組。
　　 3、胰島素放免試法檢測(cè)各組INS-1細(xì)胞胰島素量:在干預(yù)結(jié)束后,各組細(xì)胞先用0mM糖KRHB緩沖液沖沈兩遍,再依次用含0mM糖、2.5mM糖、15mM糖的KRHB緩沖液分別孵育30min、1h、1h。收集上清用于胰島素放免測(cè)定。測(cè)定各組蛋白含量,用于均衡各組胰島素分泌量。
　　 4、四氮唑藍(lán)(MTT)法檢測(cè)各組細(xì)胞活力:各組細(xì)胞干預(yù)結(jié)束后,分別經(jīng)MTT、二甲亞砜處理,酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔490nm處的光吸收值(OD

13、值)。結(jié)果以正常對(duì)照組0D值標(biāo)化余各組0D值,即設(shè)定正常對(duì)照組細(xì)胞活力為100％,由此計(jì)算余各組細(xì)胞活力百分比。
　　 5、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理:采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析,實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差((x)±s)表示,多組資料比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)、單向方差分析(One-wayANOVA)和協(xié)方差分析,進(jìn)一步多重比較采用LSD法(Least-significantdifference test),方差不齊性時(shí),用Welch法校正,

14、當(dāng)P<0.05時(shí)用Games-Howell法作多重比較。P<0.05被認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 [結(jié)論]
　　 1、IL-1β能夠顯著的抑制INS-1細(xì)胞的分泌功能,減少Ins-1細(xì)胞的數(shù)量,且呈劑量依賴性和時(shí)間依賴性。提示IL-1β對(duì)INS-1細(xì)胞存在著顯著的損傷作用。
　　 2、GLP-1能顯著改善IL-1β對(duì)INS-1細(xì)胞功能的抑制,增加INS-1細(xì)胞的數(shù)量。提示GLP-1能夠減輕IL-1β對(duì)INS-

15、1細(xì)胞的損傷作用。
　　 第二章 GLP-1保護(hù)IL-1β誘導(dǎo)Ins-1細(xì)胞損傷的機(jī)制初探
　　 [目的]
　　 初步探討GLP-1對(duì)IL-1β?lián)p傷INS-1細(xì)胞的保護(hù)機(jī)制。
　　 [研究對(duì)象和方法]
　　 1、以大鼠胰島細(xì)胞瘤株INS-1細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)對(duì)象；
　　 2、實(shí)驗(yàn)分組
　　 第1組:正常對(duì)照組(Untreated gloup),以下簡(jiǎn)稱對(duì)照組；
　　 第2組:10n

16、g/ml rIL-1β干預(yù)INS-1細(xì)胞組,以下簡(jiǎn)稱IL-1β組；
　　 第3組:在10ng/ml rIL-1β干預(yù)INS-1細(xì)胞前,予以hGLP-1預(yù)處理18小時(shí),且間隔12小時(shí)追加一次相同劑量的hGLP-1,以下簡(jiǎn)稱GLP-1+IL-1β組；
　　 3、采用熒光定量(real time)PCR法檢測(cè)各組IKKβ和PDX-1 mRNA水平
　　 4、免疫印跡法(Western blot)檢測(cè)NF-κB蛋白在細(xì)胞

17、核內(nèi)表達(dá)
　　 5、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理:采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析,實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示,多組資料比較采用單向方差分析(One-way ANOVA),進(jìn)一步多重比較采用LSD法(Least-significant difference test),方差不齊性時(shí),用Welch法校正,當(dāng)P<0.05時(shí)用Games-Howell法作多重比較。P<0.05被認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義
　　 [結(jié)論]