GLP-1對(duì)AGEs誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的拮抗作用及機(jī)制研究.pdf

1、目的：
　　建立糖基化終末產(chǎn)物（AGEs）誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)模型，探討GLP-1是否具有拮抗AGEs誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激從而保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞的作用，并探討GLP-1是否可通過NADPH-、PKA-eNOS信號(hào)途徑發(fā)揮抗氧化、抗凋亡及抗線粒體損傷的作用。
　　方法：
　　1.人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)的分離、培養(yǎng)及鑒定。
　　標(biāo)本均來(lái)源于廣東藥學(xué)院附屬第一醫(yī)院婦產(chǎn)科正常足月妊娠新生兒臍帶經(jīng)消毒、

2、沖洗、0.1％的Ⅰ型膠原酶消化、收集等步驟得到分離的細(xì)胞。分離后接種細(xì)胞于培養(yǎng)瓶，置于37℃、5％二氧化碳(Carbon dioxide，CO2)培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞生長(zhǎng)融合達(dá)80％以上時(shí)，進(jìn)行消化傳代，取生長(zhǎng)良好的第3代細(xì)胞用于鑒定。使用免疫熒光法檢測(cè)內(nèi)皮細(xì)胞的標(biāo)志物第Ⅷ因子相關(guān)抗原(VonWillebrand factor，vWF)。
　　2.建立AGEs誘導(dǎo)的HUVECs氧化損傷模型，探討AGEs對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的損傷作用。

3、>　　牛血清白蛋白(Bovine serum albumin，BSA)與D-葡萄糖溶于PBS中，避光孵育12周制備AGEs。熒光分光光度計(jì)鑒定AGEs。以同樣條件下不含糖的BSA溶液孵育12周后制備的溶液作為本實(shí)驗(yàn)的陰性對(duì)照組。
　　實(shí)驗(yàn)分為:空白對(duì)照組、AGEs(100、200、400、600、800 ug/mL)組，以上6組作用HUVECs24 h（該部分結(jié)果將確定AGEs作用濃度，之后本論文的AGEs及BSA濃度不再特別說明

4、，均采用該濃度）;以上確定作用濃度的AGEs分別作用HUVECs12、24、36、48 h，另設(shè)一空白對(duì)照組。每孔加入10μM二氯熒光黃雙乙酸鹽(Dichlorofluorescein diace-tate，DCFH-DA)，經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)熒光強(qiáng)度。
　　確定BSA及AGEs作用濃度及時(shí)間后，實(shí)驗(yàn)分為:空白組、BSA組、AGEs組。配置四氯四乙基苯并咪唑基羰花青碘化物(5，5'，6，6'-tetrachloro-1，1'，3，3

5、'-tetrethyl benzimidalyl carbocyanine iodide，JC-1)工作液后與HUVECs共孵育，經(jīng)流式細(xì)胞儀進(jìn)行熒光檢測(cè)細(xì)胞線粒體膜電位的變化。按磷脂酰絲氨酸結(jié)合蛋V/碘化丙啶(AnnexinⅤ/Propidium iodide，AnnexinⅤ/PI)凋亡試劑盒說明書要求處理細(xì)胞后，經(jīng)流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞凋亡。
　　3.煙酰胺腺嘌呤二核苷酸酸氧化酶4(Triphopyridine nucleoti

6、deoxidase4，NOX4)在GLP-1對(duì)AGEs誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞中的作用。
　　空白對(duì)照組、BSA組、AGEs組、GLP-1組、AGEs+GLP-1組，通過蛋白印跡法（Western Blotting法）檢測(cè)NOX4蛋白表達(dá)。GLP-1預(yù)處理細(xì)胞30 min后再加入AGEs，GLP-1濃度采用100 nM。（本課題前期研究顯示，該濃度下GLP-1可顯著抑制AGEs誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。）（以下部分均按該順序操作，不再贅述。）

7、>　　空白對(duì)照組、AGEs組、GLP-1組、AGEs+GLP-1組，通過逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Reverse transcription PC，RT-PCR）檢測(cè)HUVECs的NOX4信使核糖核酸(Messenger RNA，mRNA)表達(dá)。
　　空白對(duì)照組、AGEs組、AGEs+陰性對(duì)照siRNA組、AGEs+ NOX4siRNA組，檢測(cè)NOX4表達(dá)抑制前后，HUVECs的細(xì)胞凋亡率、ROS及線粒體膜電位水平。采用lipo-20

8、00進(jìn)行NOX4干擾性小核糖核酸(Small interfering RNA，siRNA)轉(zhuǎn)染，陰性干擾組采用亂序的siRNA為錯(cuò)配對(duì)照組，應(yīng)用RT-PCR鑒定轉(zhuǎn)染結(jié)果。
　　4.蛋白激酶A-(Protein kinase A，PKA-)、內(nèi)皮型一氧化氮合酶-(Endothelialnitric oxide synthase，eNOS-)在GLP-1對(duì)AGEs誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞中的作用
　　空白對(duì)照組、BSA組、AGEs組、G

9、LP-1組、AGEs+GLP-1組分別檢測(cè)PKA蛋白表達(dá)。
　　空白對(duì)照組、AGEs組、GLP-1組、AGEs+GLP-1組、AGEs+GLP-1+PKA抑制劑組，檢測(cè)細(xì)胞eNOS蛋白表達(dá)、ROS生成水平及細(xì)胞凋亡率
　　空白對(duì)照組、BSA組、AGEs組、GLP-1組、AGEs+GLP-1組、AGEs+GLP-1+eNOS抑制劑組，檢測(cè)細(xì)胞一氧化氮（Ntrogen monoxide，NO）生成水平及細(xì)胞凋亡率。
　　抑

10、制劑預(yù)處理細(xì)胞lh后，加入（或不加）GLP-1100 nM干預(yù)30 min，最后加AGEs。
　　5.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理
　　數(shù)據(jù)采用SPSS17.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（(x)±s）表示，統(tǒng)計(jì)方法采用單向方差分析(One-Way ANOVA)，其中兩兩比較采用LSD法，相關(guān)分析采用Spearman相關(guān)分析法，P＜0.050為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果：
　　1.充分掌握好消化時(shí)間，可得到純度較高的HUVE

11、Cs。
　　2.當(dāng)AGEs作用濃度達(dá)400 ug/mL時(shí)，細(xì)胞ROS含量熒光值達(dá)到最大，當(dāng)AGEs作用24 h后，細(xì)胞ROS含量熒光值達(dá)到最大。
　　3.GLP-1抑制AGEs誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷。
　　與空白組相比，BSA不影響內(nèi)皮細(xì)胞ROS生成(P=0.996)，AGEs處理組較空白組ROS生成明顯增多(P=0.007)，而GLP-1與AGEs共孵育組較AGEs單獨(dú)處理組的ROS熒光強(qiáng)度明顯減弱（P=0.010）

12、。
　　對(duì)AGEs誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡及細(xì)胞線粒體膜電位下降，加入GLP-1后可顯著降低細(xì)胞凋亡率（P=0.000），升高線粒體膜電位(P=0.014)。
　　4.NOX4在GLP-1對(duì)AGEs誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞中的作用。
　　AGEs促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞NOX4基因表達(dá)及其蛋白的合成，與空白對(duì)照組相比差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P值分別為0.000和0.001）;在AGEs組加入GLP-1后，可顯著抑制內(nèi)皮細(xì)胞NOX4基因的表達(dá)及蛋白

13、合成，與AGEs組相比差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P值分別為0.000和0.003）。
　　在AGEs誘導(dǎo)下，抑制NOX4mRNA表達(dá)后，內(nèi)皮細(xì)胞ROS含量熒光值顯著降低，與單純AGEs處理組及AGEs+陰性干擾組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P值分別為0.011和0.010）。
　　干擾NOX4mRNA基因表達(dá)可顯著拮抗AGEs誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡及線粒體膜電位下降（P值分別為0.000和0.017），而予以非NOX4siRNA的小干擾處理

14、則不影響細(xì)胞凋亡率及線粒體膜電位（P值分別為0.169和0.741）。
　　5.PKA-在GLP-1對(duì)AGEs誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞中的作用。
　　與空白對(duì)照組相比，BSA并不影響內(nèi)皮細(xì)胞PKA蛋白表達(dá)（P=0.186），而AGEs可誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞的PKA蛋白表達(dá)顯著下調(diào)(P=0.003);與AGEs單獨(dú)處理組相比，加入GLP-1共孵育后，AGEs誘導(dǎo)的PKA蛋白較AGEs組顯著上調(diào)(P=0.003)。
　　AGEs組加入GL

15、P-1后，其ROS含量熒光值較單純AGEs組降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.013); AGEs+GLP-1組加入PKA抑制劑H-89·2HCl后，細(xì)胞ROS含量較加入H-89·2HCl前升高(P=0.045)，即抑制PKA蛋白表達(dá)后可部分拮抗GLP-1對(duì)AGEs誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞ROS生成的抑制作用。
　　GLP-1與AGEs共孵育組的細(xì)胞凋亡率顯著低于AGEs組(P=0.001);PKA抑制劑H-89·2HCl可顯著拮抗GLP-1對(duì)

16、AGEs誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的抑制作用(P=0.010)。
　　GLP-1與AGEs共孵育組的細(xì)胞線粒體膜電位顯著高于AGEs組(P=0.011);加入PKA抑制劑H-89·2HCl后，與AGEs+GLP-1組相比，細(xì)胞線粒體膜電位顯著降低(P=0.021)。
　　6.eNOS-在GLP-1對(duì)AGEs誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞中的作用。
　　與空白組相比，AGEs可誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞eNOS蛋白表達(dá)顯著下調(diào)(P=0.004);在AGEs中加入

17、GLP-1后，可使受抑制的eNOS蛋白表達(dá)再次上調(diào)(P=0.035);AGEs組予以H-89·2HCl干預(yù)后，AGEs對(duì)eNOS蛋白表達(dá)的抑制作用無(wú)明顯改變（P=0.908）;而AGEs+GLP-1組予以H-89·2HCl干預(yù)后，細(xì)胞eNOS蛋白表達(dá)受抑制（P=0.045）。
　　eNOS抑制劑L-NAME干預(yù)前，AGEs+GLP-1組較AGEs組NO水平顯著升高(P=0.017)，細(xì)胞凋亡率顯著降低(P=0.000)。L-NAM

18、E干預(yù)后，AGEs+GLP-1組NO生成明顯受抑制(P=0.017)，且細(xì)胞凋亡率增加(P=0.011)。
　　結(jié)論：
　　1.成功建立一種能大量分離HUVECs的體外培養(yǎng)方法。
　　2.GLP-1可通過抑制NOX4或激活PKA信號(hào)通道，拮抗AGEs誘導(dǎo)的HUVECs氧化應(yīng)激及線粒體損傷，從而發(fā)揮內(nèi)皮細(xì)胞保護(hù)作用。
　　3.在AGEs誘導(dǎo)的HUVECs損傷中，GLP-1可通過PKA-eNOS-NO信號(hào)通道發(fā)揮保護(hù)