p38 MAPK信號通道介導的GLP-1對AGEs誘導內(nèi)皮細胞損傷的干預機制.pdf

1、背景：
　　糖尿病(Diabetes mellitus, DM)可并發(fā)多種血管并發(fā)癥，如糖尿病腎病、動脈粥樣硬化、中風、心衰等，而后者是其致殘致死的重要原因。內(nèi)皮細胞功能紊亂是DM并發(fā)動脈粥樣硬化(Atherosclerosis, AS)發(fā)生的早期信號，因此，保護血管內(nèi)皮細胞功能對治療及預防糖尿病血管病變具有重要意義。糖基化終末產(chǎn)物（Advanced glycation endproducts, AGEs）的積累與DM多種血管并發(fā)

2、癥的發(fā)生及發(fā)展密切相關。研究表明，AGEs可導致多種細胞因子分泌異常及細胞代謝紊亂，進而引起內(nèi)皮細胞結(jié)構(gòu)改變和功能異常。糖尿病高糖狀態(tài)下，AGEs生成明顯加速，并在血管壁沉積而難以降解，通過與其受體結(jié)合后激活氧化應激，誘導活性氧(reactive oxygen species, ROS)生成明顯增加，破壞內(nèi)皮細胞功能，導致線粒體功能障礙，并促使其凋亡。因此，如何對抗AGEs的血管損傷效應，已成為眾多學者關注的問題。
　　p38細胞

3、絲裂素活化蛋白激酶（p38 mitogen-activated protein kinase, p38 MAPK）信號通路為MAPK家族的重要成員，該通路作用的發(fā)揮主要是通過磷酸化p38 MAPK（p-p38 MAPK）實現(xiàn)的。研究顯示，p38 MAPK信號通路的激活與血管損傷和器官微循環(huán)的病理生理改變有著密切關聯(lián)。如AGEs通過p38 MAPK信號通路介導了腎臟微血管內(nèi)皮的損傷及血流屏障的影響；抑制p38 MAPK活化可減輕高糖誘導的

4、腎小球系膜細胞氧化應激水平，使ROS生成量降低；高糖干預人冠狀動脈一段時間后，可通過增強NADPH氧化酶活性，使ROS產(chǎn)生增加，而高糖及ROS均可激活p38 MAPK信號通路，從而誘導細胞損傷。高糖及ROS均可激活p38MAPK磷酸化而促進細胞凋亡已得到共識，但其具體機制尚不明確。文獻報道，一定濃度的AGEs可通過p38 MAPK信號通路介導，使內(nèi)皮細胞中內(nèi)皮型一氧化氮合酶（eNOS）表達下調(diào)，NO生成減少，從而促進細胞凋亡。
　

5、　胰高血糖素樣肽1（Glucagon like Peptide-1, GLP-1)是由腸道內(nèi)分泌細胞和腦神經(jīng)細胞分泌的多肽類激素，不僅可通過促進胰島素分泌、抑制胰高血糖素釋放等發(fā)揮良好的降糖效果，還具有心血管系統(tǒng)保護作用，是治療 T2DM非常有前景的新藥。近年研究顯示，除抗炎作用外，GLP-1還可通過cAMP/PKA、PI3K/Akt、NADPH、p38 MAPK等信號途徑發(fā)揮抗氧化損傷作用，從而對內(nèi)皮細胞發(fā)揮有效保護作用。研究表明，在

6、高糖誘導的內(nèi)皮細胞損傷中，GLP-1或其類似物Exendin-4可激活PI3K/Akt，提高NO水平從而促內(nèi)皮細胞增殖；而其下游信號通道 p38MAPK-eNOS也在 GLP-1保護高糖誘導的內(nèi)皮細胞損傷中發(fā)揮重要作用。但目前相關研究仍甚少。
　　由此可見，在DM各種代謝紊亂的環(huán)境中，激活氧化應激是AGEs誘導血管內(nèi)皮細胞損傷的關鍵病理因素。GLP-1在降糖的同時，可拮抗AGEs誘導的氧化應激而保護血管內(nèi)皮細胞。然而，其具體保護機

7、制尚不明了。本研究以 AGEs誘導的人臍靜脈內(nèi)皮細胞（human umbilical vein endothelial cells, HUVECs）為研究模型，探討p38 MAPK-信號通道在GLP-1干預AGEs誘導內(nèi)皮細胞損傷中的作用機制，從而為疾病的發(fā)生及治療研究展示廣闊的前景。
　　目的：
　　本課題以AGEs誘導的HUVECs損傷為研究模型，通過檢測GLP-1對p38 MAPK信號通道及其下游eNOS蛋白表達的影響

8、，觀察GLP-1或p38 MAPK抑制劑干預對血管內(nèi)皮細胞ROS生成及細胞凋亡的作用，初步探討p38 MAPK信號通道在GLP-1干預AGEs誘導血管內(nèi)皮細胞損傷中的作用機制。
　　方法：
　　1. HUVECs的分離、培養(yǎng)及鑒定
　　根據(jù)前期經(jīng)驗獲取、分離、培養(yǎng)HUVECs，細胞經(jīng)vWF抗體免疫熒光染色進行鑒定。取第3-5代細胞用于后續(xù)實驗。
　　2.體外制備、鑒定AGEs
　　1.6 g牛血清白蛋白（B

9、SA）與3.0 g D-葡萄糖溶于10 mL PBS中，避光孵育12周制備AGEs。熒光分光光度計鑒定AGEs。以同樣條件下不含糖的BSA溶液孵育12周后制備的溶液作為本實驗的陰性對照組。
　　3.Western blotting法檢測p38 MAPK、eNOS磷酸化作用
　　陰性對照組、AGEs組、GLP-1組、AGEs+GLP-1組分別檢測p38 MAPK磷酸化蛋白及總p38 MAPK蛋白表達；陰性對照組、AGEs組、A

10、GEs+GLP-1組、AGEs+p38 MAPK抑制劑組、AGEs+GLP-1+p38 MAPK抑制劑組分別檢測eNOS磷酸化蛋白及總eNOS蛋白表達。
　　p38 MAPK抑制劑預處理細胞1 h后，加入（或不加）GLP-1100 nM干預30 min,最后加400 ug/mL AGEs作用24 h(本課題前期研究顯示，400 ug/mL AGEs作用24 h后，可顯著誘導內(nèi)皮細胞凋亡；GLP-1采用100 nm濃度下，可顯著抑制

11、AGEs誘導的細胞凋亡)。陰性對照組采用與AGEs相同濃度的BSA溶液。（以下部分均按該方法操作，不再贅述。）
　　4.流式細胞儀檢測GLP-1及p38 MAPK抑制劑對細胞ROS生成水平及細胞凋亡率的影響。
　　實驗分6組：陰性對照組、AGEs組、GLP-1組、AGEs+GLP-1組、AGEs+p38 MAPK抑制劑組、AGEs+GLP-1+p38 MAPK抑制劑組。
　　細胞接種于6孔板，隨機進行分組處理，DCFH

12、-DA熒光探針檢測細胞ROS含量，Annexin V/PI染色法檢測細胞凋亡率。
　　5.硝酸還原酶法檢測eNOS抑制劑使用前后AGEs及AGEs+GLP-1處理組細胞NO生成水平。
　　6. Annexin V/PI雙染色法檢測eNOS抑制劑使用前后AGEs及AGEs+GLP-1處理組的細胞凋亡率。
　　統(tǒng)計學處理：
　　數(shù)據(jù)采用SPSS17.0進行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（x-±s）表示，多組比較采用單向

13、方差分析（One-Way ANOVA）檢驗，兩兩比較采用LSD法。P<0.050為差異有統(tǒng)計學意義。
　　結(jié)果：
　　1.GLP-1對AGEs誘導下HUVECs p38 MAPK磷酸化作用的影響
　　方差分析顯示，各組間細胞磷酸化p38 MAPK蛋白表達具有顯著差異（F=56.989,P=0.000），而總p38 MAPK蛋白表達無變化（F=0.568,P=0.652）。與BSA對照組比較，AGEs可顯著活化內(nèi)皮細胞p

14、38 MAPK蛋白磷酸化（P=0.001），而GLP-1可拮抗該活化作用（P=0.000）。
　　2.p38 MAPK抑制劑（SB203580）對HUVECseNOS磷酸化作用的影響
　　予以不同處理后，各組間細胞磷酸化 eNOS蛋白表達具有顯著統(tǒng)計學差異（F=6.645,P=0.007），但總eNOS水平無統(tǒng)計學差異（F=1.677,P=0.231）。與BSA對照相比較，AGEs可顯著降低磷酸化 eNOS表達水平（P=0.

15、007），GLP-1及SB203580均可拮抗AGEs對磷酸化eNOS的抑制作用（P=0.004）（P=0.011）。
　　3.AGEs誘導下，GLP-1及p38 MAPK抑制劑對HUVECs ROS生成及細胞凋亡的影響
　　與 BSA對照組相比，AGEs處理組 ROS生成水平及細胞凋亡率顯著增高（P=0.000）（P=0.000），GLP-1單獨處理并不影響細胞ROS生成量及細胞凋亡率（P=0.170）（P=0.234）；

16、而AGEs組加入GLP-1或SB203580后，細胞ROS水平均顯著減弱（ P=0.000）（ P=0.006），細胞凋亡率顯著下降（ P=0.000）（P=0.000）；予以SB203580預處理后，GLP-1對AGEs誘導ROS生成及細胞凋亡的拮抗作用無改變（P=0.828）（P=0.424）。
　　4. AGEs誘導下，GLP-1及eNOS抑制劑（L-NAME）對HUVECs NO生成水平的影響
　　方差分析后多重比較

17、顯示，與BSA陰性對照組相比，AGEs可明顯降低NO生成水平（P=0.000），而 GLP-1單獨處理對細胞 NO生成的影響無統(tǒng)計學意義（P=0.055）；AGEs組加入GLP-1后，細胞NO含量較單純AGEs處理組顯著升高（P=0.000）；而在AGEs+ GLP-1組予以L-NAME預處理細胞后，細胞NO含量較AGEs+ GLP-1組降低（P=0.011）。
　　5. AGEs誘導下，eNOS抑制劑對GLP-1抗細胞凋亡的影響

18、
　　加入 GLP-1與 AGEs共孵育后，細胞凋亡率較單純 AGEs組顯著降低（P=0.000）；而在AGEs+GLP-1共孵育組加入L-NAME后，GLP-1的抗凋亡作用顯著減弱（P=0.002）。
　　結(jié)論：
　　1.AGEs可激活血管內(nèi)皮細胞p38 MAPK信號通道，而GLP-1可拮抗該作用。
　　2.GLP-1可通過抑制p38 MAPK信號通道的活化，拮抗AGEs誘導的血管內(nèi)皮細胞氧化應激反應及細胞凋亡