GLP-1對人肝細胞糖原合成酶活性的影響及其與MAPK信號通路的研究.pdf

1、目的:
　　 1.體外培養(yǎng)人肝細胞L02細胞系。
　　 2.研究胰高血糖素樣肽-1(GLP-1)在人肝細胞L02細胞系的糖原合成信號轉導通路-MAPK通路。
　　 3.為GLP-1的擬胰島素作用及其相關藥物的臨床應用的安全性和有效性提供理論依據(jù)。
　　 方法:
　　 1.體外培養(yǎng)人肝細胞L02細胞系,通過倒置顯微鏡形態(tài)學觀察。
　　 2.實驗分兩部分:
　　 (1)第一部分:MTT

2、方法檢查GLP-1、INS對肝細胞存活數(shù)量的影響,是否有疊加作用。
　　 (2)第二部分:蛋白質印跡(western blot)檢查來驗證GLP-1對肝細胞糖原-合成信號轉導通路-MAPK通路的影響。分組為:Ctrl組,GLP-1(10nmol/l)組,GLP-1(10nmol/l)+PD98059組(25μmol/l),PD98059(25μmol/l)組,INS(10nmol/l)組,GLP-1+INS(10nmol/l)組

3、。
　　 3.western blot測定磷酸化糖原合成酶(p-GS)和糖原合成酶(GS)的表達。
　　 4.通過western blot測定的P-GS與GS的表達量的光密度比值測定糖原合成酶的活性。
　　 結果:
　　 1.人肝L02細胞的傳代培養(yǎng)情況良好。
　　 2.GLP-1組、INS組、GLP-1+INS聯(lián)合組的OD值均明顯高于Ctrl組,而GLP-1+INS聯(lián)合組OD值又明顯高于GLP-

4、1組、INS組。表明INS、GLP-1可以促進肝細胞的生長,且這種作用可以疊加。
　　 3.western blot結果示:與Ctrl組相比,INS組、GLP-1組的磷酸化糖原合成酶(p-GS)表達有明顯減少。GLP-1組與GLP-1+PD組相比有明顯的差異。GLP-1+INS與Ctrl組、GLP-1組、INS組比較p-GS表達明顯減少。表明INS、GLP-1均可促進P-GS向GS的轉化,且這種作用可以疊加。MAPK阻斷劑PD部

5、分阻斷了GLP-1的這一作用。
　　 4.western blot表明,與Ctrl組相比GLP-1組、INS組的糖原合成酶(GS)表達有明顯增加。GLP-1組與GLP-1+PD組相比有明顯的差異,表明MAPK特異性阻斷劑PD部分阻斷了GLP-1促進GS表達的作用。GLP-1+INS與Ctrl組、GLP-1組、INS組比較GS表達明顯增高。表明INS、GLP-1可以促進糖原合成酶的表達,且這種作用可以疊加。
　　 5.用P

6、-GS/GS的比值來表示GS的活性,比值越大,GS的活性越低。結果顯示,與Ctrl組相比,GLP-1組、INS組、GLP-1+INS組GS的活性均明顯提高；表明INS、GLP-1可以增加GS的活性。GLP-1組、INS組與兩者聯(lián)合組比較,GS的活性較低,表明INS、GLP-1組聯(lián)合對GS活性的增加有疊加作用。與GLP-1組相比,GLP-1+PD98059組的GS的活性明顯降低,表明MAPK阻斷劑PD部分阻斷了GLP-1促進GS活性增加的

7、作用。
　　 結論:本研究通過體外實驗證實GLP-1、INS均能促進人肝L02細胞系的生長,GLP-1和INS聯(lián)合應用對其生長具有疊加作用。INS,GLP-1可直接作用于人肝細胞,促進失活狀態(tài)的磷酸化的GS轉化為具有活性的GS,上調糖原合成酶的表達,從而增加肝細胞中GS的活性來促進糖原合成。且這種作用可以疊加。MAPK抑制劑能夠阻斷GLP-1在肝細胞中介導的糖原合成酶的上調表達和糖原合成酶活性的增加,表明MAPK通路可能對GLP