GLP-1對HepG2細(xì)胞糖異生關(guān)鍵酶G6Pase的影響及作用機(jī)制研究.pdf

1、目的：
　　 1.體外培養(yǎng)人肝腫瘤細(xì)胞HepG2細(xì)胞系，通過倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)變化。
　　 2.研究胰高血糖素樣肽-1(glucagon-like peptide-1，GLP-1)對HepG2細(xì)胞糖異生的作用及機(jī)制-PI3K通路。
　　 3.為GLP-1有效的降糖和改善肝胰島素抵抗等臨床治療提供初步的理論依據(jù)。
　　 方法：
　　 1.體外培養(yǎng)人肝腫瘤細(xì)胞-HepG2細(xì)胞，通過倒置顯微鏡形態(tài)學(xué)

2、觀察。
　　 2.將培養(yǎng)的HepG2細(xì)胞隨機(jī)分為4組：Control組，GLP-1(10nmol/L)組，Insulin(10nmol/L)組，Exenatide(10nmol/L)組，除Control組外，其它三組分別干預(yù)4、8、24小時(shí)。Western blot方法測糖異生關(guān)鍵酶葡萄糖-6-磷酸酶(glucose-6-phosphatase，G6Pase)的蛋白表達(dá)，選出合適的干預(yù)時(shí)間。
　　 3.將培養(yǎng)的HepG2

3、細(xì)胞隨機(jī)分為9組：①Control組，②Insulin(10nmol/L)組，③GLP-1(10nmol/L)組，④Exenatide(10nmol/L)組，⑤LY294002(15μMol/L)組，⑥GLP-1(10nmol/L)+Insulin(10nmol/L)組，⑦Exenatide(10nmol/L)+Insulin(10nmol/L)組，⑧GLP-1(10nmol/L)+LY294002(15μmol/L)組，⑨Exenat

4、ide(10nmol/L)+LY294002(15μmol/L)組。干預(yù)一定時(shí)間后(時(shí)間待定)，用蛋白質(zhì)印跡(western blot)法測定各組G6Pase的蛋白表達(dá)。
　　 4.將培養(yǎng)的HepG2細(xì)胞隨機(jī)分為3組：①Control組(5.6mmol/L葡萄糖)，②10mmol/L葡萄糖組，③20mmol/L葡萄糖組。干預(yù)一定時(shí)間后(時(shí)間待定)，western blot法測定各組G6Pase的蛋白表達(dá)。觀察葡萄糖對G6Pase

5、的影響。
　　 結(jié)果
　　 1.HepG2肝細(xì)胞傳代培養(yǎng)情況良好。
　　 2.western blot結(jié)果表明：與Control組比，GLP-1組、Insulin組、Exenatide組G6Pase的蛋白表達(dá)量較低，干預(yù)8小時(shí)后降低最明顯，所以下一步實(shí)驗(yàn)干預(yù)時(shí)間選擇8小時(shí)。
　　 3.(1)與Control組比，Insulin、GLP-1、Exenatide均能降低HepG2肝細(xì)胞G6Pase的蛋白表達(dá)量

6、(p<0.05)，表明Insulin、GLP-1、Exenatide都能抑制肝糖異生。
　　 (2)與Insulin組比，GLP-1+Insulin組和Exenatide+Insulin組G6Pase的蛋白表達(dá)量少(p<0.05)。說明GLP-1、Exenatide對G6Pase的抑制與Insulin有疊加作用，GLP-1、Exenatide調(diào)節(jié)肝糖異生代謝的通路可能與胰島素不完全一致。
　　 (3)與GLP-1組比，G

7、LP-1+LY294002組G6Pase的蛋白表達(dá)量增加(p<0.05)；與Exenatide組比，Exenatide+LY294002組G6Pase的蛋白表達(dá)量增加(p<0.05)，說明PI3K通路介導(dǎo)了GLP-1、Exenatide對肝糖異生的調(diào)節(jié)。
　　 4.與5.6mmol/L葡萄糖組比，10mmol/L葡萄糖組G6Pase的蛋白表達(dá)量無明顯變化，20mmol/L葡萄糖組G6Pase的蛋白表達(dá)量明顯增加(p<0.05)。

8、說明高糖可以促進(jìn)肝細(xì)胞的糖異生或糖原分解作用。
　　 結(jié)論：
　　 本研究通過體外試驗(yàn)驗(yàn)證了GLP-1、Exenatide可直接作用于人肝細(xì)胞，調(diào)節(jié)肝糖異生代謝。試驗(yàn)結(jié)果也證實(shí)了GLP-1、Exenatide通過減少肝細(xì)胞G6Pase的合成，抑制非糖物質(zhì)轉(zhuǎn)化為糖，減少糖異生。在GLP-1、Exenatide干預(yù)的同時(shí)給予PI3K阻斷劑LY294002后，人肝細(xì)胞G6Pase的表達(dá)量下降，肝糖異生作用受抑制。由此可知，GL