微囊藻毒素對(duì)HepG2細(xì)胞的毒性及其作用機(jī)制研究.pdf

1、水體富營(yíng)養(yǎng)化導(dǎo)致藍(lán)藻水華的頻繁發(fā)生已成為國(guó)內(nèi)外普遍關(guān)注的水環(huán)境污染問(wèn)題。藍(lán)藻水華不僅污染水體、破壞飲用水源、造成漁業(yè)損失，而且多數(shù)藍(lán)藻水華還由于產(chǎn)生藍(lán)藻毒素（cyanotoxins）而影響和危害水生生物甚至人的健康。在眾多藍(lán)藻毒素中，微囊藻毒素(microcystins，MCs)是分布最廣且毒性最強(qiáng)的一類(lèi)環(huán)七肽肝毒素。目前已發(fā)現(xiàn)超過(guò)100種MCs異構(gòu)物，它們具有廣譜的生物毒性，且化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，在自然水體中難以降解。因此，它們對(duì)人類(lèi)健康的

2、影響尤其令人關(guān)注。近年來(lái)，關(guān)于MCs對(duì)動(dòng)物或細(xì)胞的毒性及其作用機(jī)制的探索已成為MCs毒理學(xué)研究的重點(diǎn)和熱點(diǎn)。關(guān)于MCs的毒性作用及其機(jī)理研究雖然有很多新的發(fā)現(xiàn)和見(jiàn)解，但其作用的具體信號(hào)通路目前尚不完全清楚，而且存在一定的爭(zhēng)議，而該問(wèn)題的解決是進(jìn)行MCs環(huán)境和健康風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)的基礎(chǔ)。
　　本研究選擇MCs異構(gòu)體中最常見(jiàn)且毒性最大的微囊藻毒素-LR(microcystin-LR,MC-LR)，以人肝癌細(xì)胞HepG2作為實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，研究MC-

3、LR對(duì)HepG2細(xì)胞的毒性及其作用機(jī)制，以期進(jìn)一步豐富和完善MC-LR肝細(xì)胞毒性作用機(jī)制理論、解析MC-LR毒性作用的危害及評(píng)價(jià)MC-LR的環(huán)境安全風(fēng)險(xiǎn)，為研究MCs對(duì)人類(lèi)健康的影響及其防護(hù)提供理論支撐。
　　研究?jī)?nèi)容及獲得的主要實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
　　(1)MC-LR對(duì)HepG2細(xì)胞的毒性作用及其特點(diǎn)
　　本研究首先通過(guò)MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞活力、流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期和凋亡、倒置熒光顯微鏡檢測(cè)細(xì)胞及細(xì)胞器形態(tài)，評(píng)價(jià)MC-LR對(duì)

4、HepG2細(xì)胞的毒性作用及其特點(diǎn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，0.1 nM-10μM MC-LR短時(shí)間暴露未對(duì)HepG2細(xì)胞的活力、細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡產(chǎn)生明顯影響;而0.1-50 nM MC-LR處理HepG2細(xì)胞96 h也未顯著改變細(xì)胞活力。高濃度MC-LR(20-100μM)暴露HepG2細(xì)胞卻顯著抑制細(xì)胞活力，并呈時(shí)間-劑量-效應(yīng)關(guān)系。用0.5-50μM MC-LR暴露HepG2細(xì)胞，倒置熒光顯微鏡鏡檢發(fā)現(xiàn)，高濃度MC-LR暴露改變HepG2細(xì)

5、胞形態(tài)、導(dǎo)致細(xì)胞損傷。Hoechst33342染色后檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，一定濃度的MC-LR暴露導(dǎo)致細(xì)胞核損傷并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。Acridmeorange染色后檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，高濃度MC-LR暴露對(duì)細(xì)胞溶酶體造成嚴(yán)重?fù)p傷，且呈時(shí)間-劑量依賴(lài)效應(yīng)關(guān)系。Rhodamine-123染色檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，較低濃度MC-LR暴露，部分HepG2細(xì)胞線粒體出現(xiàn)輕微形態(tài)改變，但無(wú)明顯結(jié)構(gòu)損傷;而高濃度MC-LR長(zhǎng)時(shí)間暴露后，HepG2細(xì)胞線粒體損傷明顯，且彌散性地分布在細(xì)胞內(nèi)

6、，這說(shuō)明MC-LR暴露對(duì)HepG2細(xì)胞的線粒體產(chǎn)生了損傷。
　　該實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，MC-LR對(duì)HepG2細(xì)胞的毒性具有濃度依賴(lài)性，非細(xì)胞毒濃度染毒對(duì)細(xì)胞活力無(wú)影響，而高濃度處理可導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。
　　(2)MC-LR對(duì)HepG2細(xì)胞代謝及其耐藥基因表達(dá)的影響
　　由于0.1 nM-10μM MC-LR暴露HepG2細(xì)胞24 h并未影響受試細(xì)胞的細(xì)胞活力、細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡。因此，我們首先要確定HepG2細(xì)胞內(nèi)是否表達(dá)MC-

7、LR特異性轉(zhuǎn)運(yùn)體—有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)多肽（OATP1B1和OATP1B3），并確定MC-LR是否真正進(jìn)入到HepG2細(xì)胞內(nèi)。通過(guò)qPCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，HepG2細(xì)胞內(nèi)確實(shí)存在OATP1B1和OATP1B基因的表達(dá)。而通過(guò)Western blot技術(shù)并使用MC-LR特異性抗體檢測(cè)，結(jié)果證實(shí)MC-LR可進(jìn)入HepG2細(xì)胞，且MC-LR處理濃度越高，檢測(cè)到細(xì)胞內(nèi)MC-LR特異性條帶越強(qiáng)。MC-LR雖然可進(jìn)入HepG2細(xì)胞，但低濃度染毒并未對(duì)細(xì)胞表型產(chǎn)

8、生影響。但進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，MC-LR暴露引起HepG2細(xì)胞Ⅰ相和Ⅱ相部分代謝酶及外排泵基因表達(dá)的改變，說(shuō)明MC-LR染毒可能擾亂這些代謝酶的正常功能。因此推測(cè)HepG2細(xì)胞代謝酶在MC-LR代謝和解毒過(guò)程中可能發(fā)揮作用。為了驗(yàn)證該假設(shè)，接下來(lái)我們使用CYPs誘導(dǎo)劑Omeprazole(OME)、Ethanol(ETH)和Rifampicin(RIF)處理HepG2細(xì)胞，提高代謝酶活性以證實(shí)HepG2細(xì)胞內(nèi)代謝酶是否在MC-LR的代謝過(guò)程

9、中發(fā)揮作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，用5μM MC-LR染毒后，CYPs誘導(dǎo)劑影響HepG2細(xì)胞活力，其中ETH的誘導(dǎo)作用最明顯。由于ETH是CYP2E1特異性誘導(dǎo)劑，進(jìn)一步通過(guò)CYP2E1抑制劑Chlormethiazole(CMZ)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，MC-LR可通過(guò)上調(diào)CYP2E1表達(dá)或酶活性而誘導(dǎo)產(chǎn)生過(guò)量的ROS，并對(duì)HepG2細(xì)胞產(chǎn)生毒性、引起線粒體損傷而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。通過(guò)ROS清除劑L-抗壞血酸與MC-LR共培養(yǎng)細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)ROS清除劑能減少

10、MC-LR誘導(dǎo)產(chǎn)生ROS及其誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡。
　　(3)MC-LR低濃度長(zhǎng)期暴露對(duì)HepG2細(xì)胞的影響
　　已有研究表明，低濃度MC-LR長(zhǎng)期暴露能促進(jìn)細(xì)胞增殖并誘發(fā)肝炎/肝癌。為探究該機(jī)理，本研究進(jìn)一步選擇低濃度MC-LR(0.1-30 nM)暴露HepG2細(xì)胞83 d。Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，即使極低濃度的MC-LR(0.1 nM)染毒后，該毒素也可有效地進(jìn)入HepG2細(xì)胞，但CCK-8檢測(cè)并未發(fā)現(xiàn)MC-L

11、R對(duì)細(xì)胞活力產(chǎn)生明顯的影響。然而，通過(guò)DCF熒光分析結(jié)果顯示，30 nM MC-LR暴露HepG2細(xì)胞使其ROS水平較對(duì)照組顯著上升;而5和10 nM MC-LR長(zhǎng)時(shí)間暴露促進(jìn)細(xì)胞SOD活性升高。該結(jié)果說(shuō)明，低濃度MC-LR長(zhǎng)時(shí)間暴露也能誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生過(guò)量的ROS，而細(xì)胞內(nèi)高活性SOD可能在清除過(guò)量ROS過(guò)程中發(fā)揮重要作用。采用0.1-30 nM MC-LR暴露HepG2細(xì)胞48 h，對(duì)細(xì)胞NF-κB p65、TNF-α、IL-1β和IL

12、-6的表達(dá)水平無(wú)明顯影響;而MC-LR長(zhǎng)時(shí)間暴露卻顯著提升細(xì)胞內(nèi)NF-κB p65、TNF-α、 IL-1β和IL-6的表達(dá)水平。
　　(4)高濃度MC-LR處理致HepG2細(xì)胞凋亡及其機(jī)理
　　細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，高濃度MC-LR可通過(guò)誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞產(chǎn)生過(guò)量的ROS而對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒性并導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。為探究MC-LR誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞產(chǎn)生過(guò)量ROS導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的信號(hào)途徑，我們用10-50μM MC-LR暴露HepG2細(xì)胞

13、，檢測(cè)后發(fā)現(xiàn)，HepG2細(xì)胞內(nèi)ROS水平上升、HSP70和HSP90表達(dá)增加、SOD和CAT活性降低、GSH含量降低，且較高濃度組與對(duì)照組差異顯著。另外，HepG2細(xì)胞MDA水平明顯提高。該結(jié)果說(shuō)明，高濃度MC-LR暴露誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞產(chǎn)生過(guò)量的ROS、引起細(xì)胞氧化應(yīng)激，并導(dǎo)致細(xì)胞脂質(zhì)過(guò)氧化程度加重。
　　用0.5-50μM MC-LR暴露HepG2細(xì)胞，通過(guò)Western blot和qPCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，HepG2細(xì)胞線粒體相關(guān)的

14、COX-2、Cyt-c和Smac/Diablo的表達(dá)上調(diào);p53 mRNA水平上調(diào)，并使其蛋白磷酸化水平明顯增強(qiáng);p21/WAF1、Fas和FasL表達(dá)水平普遍上調(diào)。MC-LR暴露還影響HepG2細(xì)胞Bad、Cleaved-Bid、Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)水平，促進(jìn)Bax與Bcl-2表達(dá)。MC-LR暴露顯著促進(jìn)HepG2細(xì)胞PUMA蛋白表達(dá);而30和50μM MC-LR處理6h抑制細(xì)胞survivin表達(dá)，隨后多數(shù)濃度MC-LR處理組

15、卻促進(jìn)survivin表達(dá)。另外，0.5-50μM MC-LR暴露還促進(jìn)細(xì)胞Caspase-3和Caspase-9 mRNA水平提升和酶活性升高，而高濃度MC-LR暴露也促進(jìn)Caspase-8的表達(dá)。
　　本研究還發(fā)現(xiàn)，HepG2細(xì)胞c-myc mRNA變化與MC-LR暴露濃度和時(shí)間有關(guān)，且MC-LR能促進(jìn)c-Myc蛋白表達(dá)，高濃度MC-LR暴露24h能增強(qiáng)HepG2細(xì)胞c-Myc(phosphor S62)磷酸化水平。MC-LR

16、暴露促進(jìn)HepG2細(xì)胞c-fos和c-jun轉(zhuǎn)錄和蛋白水平提升，說(shuō)明MC-LR可能引起細(xì)胞DNA損傷并誘發(fā)遺傳毒性，而c-myc、c-fos和c-jun可能在MC-LR促進(jìn)腫瘤發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮重要作用。
　　本研究的主要結(jié)論:
　　(1)MC-LR的暴露濃度及作用時(shí)間影響其對(duì)HepG2細(xì)胞的毒性，而高濃度MC-LR處理可導(dǎo)致HepG2細(xì)胞凋亡，且線粒體和溶酶體與該過(guò)程可能密切相關(guān)。
　　(2)MC-LR可通過(guò)上調(diào)HepG

17、2細(xì)胞CYP2E1表達(dá)或酶活性而誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生過(guò)量的ROS并對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒性。
　　(3)低濃度MC-LR長(zhǎng)時(shí)間暴露可能會(huì)促發(fā)細(xì)胞的炎性反應(yīng)。
　　(4)高濃度MC-LR可通過(guò)誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞產(chǎn)生過(guò)量的ROS、激活線粒體細(xì)胞凋亡信號(hào)途徑而介導(dǎo)細(xì)胞凋亡，PUMA和survivin在其中可能發(fā)揮重要作用。
　　(5)高濃度MC-LR暴露也會(huì)激活Fas/FasL死亡受體通路，并介導(dǎo)細(xì)胞凋亡。
　　(6)MC-LR的肝細(xì)胞